Основные положения

kpccz

Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний

Complex Issues of Cardiovascular Diseases

2306-12782587-9537

Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”

10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114

kpccz-1165

Research Article

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Патологическая физиология

ORIGINAL STUDIES. Pathological physiology

Случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода в культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека

Spontaneous endothelial-to-mesenchymal transition in human primary umbilical vein endothelial cells

https://orcid.org/0000-0002-1518-3888

Шишкова

Д. К.

Shishkova

D. K.

Шишкова Дарья Кирилловна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Daria K. Shishkova - PhD, Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-4467-8732

Синицкая

А. В.

Sinitskaya

A. V.

Синицкая Анна Викторовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Anna V. Sinitskaya - PhD, Researcher at the Laboratory for Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-4824-2418

Синицкий

М. Ю.

Sinitsky

M. Yu.

Синицкий Максим Юрьевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Maxim Yu. Sinitsky - PhD, Senior Researcher at the Laboratory for Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-4146-3373

Матвеева

В. Г.

Matveeva

V. G.

Матвеева Вера Геннадьевна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Vera G. Matveeva - MD, PhD, Senior Researcher at the Laboratory for Tissue Engineering, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-1079-1956

Великанова

Е. А.

Velikanova

E. A.

Великанова Елена Анатольевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Elena A. Velikanova - PhD, Researcher at the Laboratory for Tissue Engineering, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-6652-5745

Маркова

В. Е.

Markova

V. E.

Маркова Виктория Евгеньевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Victoria E. Markova - PhD, Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

marvika97@gmail.com

https://orcid.org/0000-0001-8679-4857

Кутихин

А. Г.

Kutikhin

A. G.

Кутихин Антон Геннадьевич - кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Anton G. Kutikhin - MD, PhD, Head of the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеванийРоссияResearch Institute for Complex Issues of Cardiovascular DiseasesRussian Federation

2022

12102022

11397114

2022

Шишкова Д.К., Синицкая А.В., Синицкий М.Ю., Матвеева В.Г., Великанова Е.А., Маркова В.Е., Кутихин А.Г.

Shishkova D.K., Sinitskaya A.V., Sinitsky M.Y., Matveeva V.G., Velikanova E.A., Markova V.E., Kutikhin A.G.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://www.nii-kpssz.com/jour/article/view/1165

Основные положения

Основные положения. Спонтанный эндотелиально-мезенхимальный переход первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека характеризуется многократным повышением уровня экспрессии генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, полной потерей экспрессии маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (CD31/PECAM1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG), ярко выраженной экспрессией генов маркеров мезенхимальной дифференцировки (фибробласт-специфичного белка и альфа-актина гладких мышц) и выраженным синтезом основного компонента внеклеточного матрикса коллагена I типа. Оптимальным алгоритмом определения эндотелиально-мезенхимального перехода является определение транскрипции генов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, генов мезенхимальной дифференцировки (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) с последующей верификацией отрицательной экспрессии маркеров эндотелиального фенотипа и положительной экспрессии коллагена I типа внутри клеток посредством иммуно-флюоресцентного окрашивания.

Цель

Цель. На основании случая спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода разработать алгоритм и предложить инструменты для его детекции in vitro.

Материалы и методы

Материалы и методы. В эксперимент включены две серии первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC): первая серия – классический эндотелиальный морфотип, вторая – спонтанно подвергшиеся эндотелиально-мезенхимальному переходу. В качестве отрицательного контроля (клетки с эндотелиальным морфотипом) также использованы первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (HCAEC) и первичные эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии человека (HITAEC). Оценку молекулярного профиля клеток проводили методами количественной полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции, иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного окрашивания с последующей конфокальной микроскопией.

Результаты

Результаты. В отличие от HUVEC с физиологическим профилем молекулярной экспрессии, а также артериальных эндотелиальных клеток HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода характеризовались потерей экспрессии генов маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), многократно повышенной экспрессией генов двух транскрипционных факторов перехода (SNAI2, TWIST1), приобретением экспрессии генов маркеров клеток мезенхимального ряда (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) при сохраненной экспрессии генов общесосудистых маркеров (HES1, NRP1). Отсутствие экспрессии генов специфичных сократительных маркеров (тяжелой цепи миозина гладких мышц (MYH11) и смузелина (SMTN)) в сочетании с приобретенной экспрессией гена менее специфичного сократительного маркера альфа-актина гладких мышц (ACTA2) свидетельствовало о фенотипической схожести трансформированных клеток с миофибробластами, а не c сосудистыми гладкомышечными клетками сократительного фенотипа. Анализ белковой экспрессии методом иммуноблоттинга подтвердил потерю экспрессии эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, VE-кадгерин/CDH5, ERG) и продемонстрировал сохранность экспрессии вышеуказанных общесосудистых маркеров. Отсутствие иммунофлюоресцентного свечения эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM-1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG) в сочетании с интенсивным внутриклеточным свечением основного синтезируемого белка межклеточного матрикса – коллагена I типа – также подтвердило реализацию транскрипционной программы эндотелиально-мезенхимального перехода.

Заключение

Заключение. Алгоритм оценки эндотелиально-мезенхимального перехода подразумевает измерение экспрессии генов PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1 и COL1A2, комбинированное с иммунофлюоресцентным окрашиванием на CD31/PECAM-1, VE-кадгерин и транскрипционный фактор ERG в сочетании с окрашиванием на коллаген I типа.

Highlights

Highlights. Spontaneous endothelial-to-mesenchymal transition of primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is characterized by an acquired expression of SNAI2 and TWIST1 genes, loss of endothelial markers and transcription factors (CD31/PECAM1, VE-cadherin, and ERG transcription factor), pronounced expression of S100A4 and ACTA2 genes, and active production of type I collagen, a major component of the extracellular matrix.

An optimal algorithm to detect endothelial-to-mesenchymal transition includes gene expression profiling of endothelial lineage markers (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), SNAI2 and TWIST1 transcription factors, mesenchymal specification markers (FAP, S100A4, ACTA2) and markers of extracellular matrix synthesis (COL1A1, COL1A2) along with the subsequent negative staining for CD31/PECAM1, VE-cadherin, or ERG and positive staining for intracellular type I collagen.

Aim

Aim. To develop an algorithm and tools to determine endothelial-to-mesenchymal transition (EndoMT) in vitro.

Methods

Methods. We examined two batches of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) where the first cell batch had a conventional endothelial morphology and the second cell batch underwent a spontaneous EndoMT. Human coronary artery endothelial cells (HCAEC) and human internal thoracic artery endothelial cells (HITAEC) were used as the negative control for EndoMT. Molecular profile was assessed by means of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, Western blotting, and immunofluorescence staining with the further confocal microscopy.

Results

Results. In contrast to HUVEC with the physiological profile and arterial ECs, HUVEC undergoing EndoMT lost the expression of endothelial lineage markers (PECAM1, CDH5, VWF, ERG) and acquired the expression of EndoMT transcription factors (SNAI2, TWIST1), mesenchymal markers (FAP, S100A4, ACTA2), and extracellular matrix components (COL1A1, COL1A2) while retaining expression of the common vascular markers (HES1, NRP1). Western blotting analysis confirmed the loss of endothelial markers (CD31/PECAM1, VE-cadherin/CDH5, ERG) and demonstrated retained expression of abovementioned vascular markers. Negligible expression of MYH11 and SMTN genes encoding specific contractile markers (smooth muscle myosin heavy chain and smoothelin) in combination with the acquired expression of ACTA2 gene encoding less specific contractile marker alpha smooth muscle actin indicated the phenotypic identity of EndoMT-transformed HUVEC to myofibroblasts but not contractile vascular smooth muscle cells. Loss of immunofluorescence staining of endothelial markers (CD31/PECAM-1, VE-cadherin, and ERG transcription factor) and pronounced intracellular staining of type I collagen testified to the ongoing EndoMT.

Conclusion

Conclusion. An algorithm to assess EndoMT implies measurement of the expression of PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1, and COL1A2 genes in combination with the respective immunofluorescence staining for CD31/PECAM-1, VE-cadherin, or ERG transcription factor and type I collagen.

эндотелиально-мезенхимальный переходэндотелиальная дифференцировкамезенхимальная дифференцировкаhuvecсосудистые гладкомышечные клеткимиофибробласты

endothelial-to-mesenchymal transitionendothelial differentiationmesenchymal differentiationHUVECvascular smooth muscle cellsmyofibroblasts

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2021-001 «Разработка новых фармакологических подходов к экспериментальной терапии атеросклероза и комплексных цифровых решений на основе искусственного интеллекта для автоматизированной диагностики патологий системы кровообращения и определения риска летального исхода» при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках национального проекта «Наука и университеты».

References1

Li Y., Lui K.O., Zhou B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nat Rev Cardiol. 2018;15(8):445-456. doi: 10.1038/s41569-018-0023-y.

Kovacic J.C., Dimmeler S., Harvey R.P., Finkel T.,Aikawa E., Krenning G., Baker A.H. Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease: JACC State-of-the-Art Review. J Am Coll Cardiol. 2019;73(2):190-209. doi: 10.1016/j.jacc.2018.09.089.

Chen P.Y., Schwartz M.A., Simons M. Endothelial-to-Mesenchymal Transition, Vascular Inflammation, and Atherosclerosis. Front Cardiovasc Med. 2020;7:53. doi: 10.3389/fcvm.2020.00053.

Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(9):2357-2369. doi: 10.1161/ATVBAHA.121.313788.

Peng Q., Shan D., Cui K., Li K., Zhu B., Wu H., Wang B., Wong S., Norton V., Dong Y., Lu Y.W., Zhou C., Chen H. The Role of Endothelial-to-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Cells. 2022;11(11):1834. doi: 10.3390/cells11111834.

Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Velikanova E.A., Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Markova V.E. Endothelial Dysfunction in the Context of Blood-Brain Barrier Modeling. J Evol Biochem Physiol. 2022;58(3):781-806. doi: 10.1134/S0022093022030139.

Kutikhin A.G., Tupikin A.E., Matveeva V.G., Shishkova D.K., Antonova L.V., Kabilov M.R., Velikanova E.A. Human Peripheral Blood-Derived Endothelial Colony-Forming Cells Are Highly Similar to Mature Vascular Endothelial Cells yet Demonstrate a Transitional Transcriptomic Signature. Cells. 2020;9(4):876. doi: 10.3390/cells9040876.

Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Кривкина Е.О., Глушкова Т.В., Севостьянова В.В., Кутихин А.Г., Антонова Л.В. Формирование монослоя эндотелиальных клеток на поверхности сосудистого протеза малого диаметра в условиях потока. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2021. Т. 23. № 3. С. 101-114. doi: 10.15825/1995-1191-2021-3-101-114.

Khanova M.Yu., Velikanova E.A., Matveeva V.G., Krivkina E.O., Glushkova T.V., Sevostianova V.V., Kutikhin A.G., Antonova L.V. Endothelial cell monolayer formation on a small-diameter vascular graft surface under pulsatile flow conditions. Bulletin of Transplantology and Artificial Organs. 2021;3(23):101-114. doi: 10.15825/1995-1191-2021-3-101-114.

Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., Shabaev A.R., Frolov A.V., Stasev A.N., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. EMbedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy: A Detailed Protocol for the Whole-Specimen, High-Resolution Analysis of Cardiovascular Tissues. Front Cardiovasc Med. 2021;8:739549. doi: 10.3389/fcvm.2021.739549.

Ma J., Sanchez-Duffhues G., Goumans M.J., Ten Dijke P. TGF-β-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition in Disease and Tissue Engineering. Front Cell Dev Biol. 2020;8:260. doi: 10.3389/fcell.2020.00260.

Ma J., van der Zon G., Gonçalves M.A.F.V., van Dinther M., Thorikay M., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-β-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition Is Determined by a Balance Between SNAIL and ID Factors. Front Cell Dev Biol. 2021;9:616610. doi: 10.3389/fcell.2021.616610.

Ma J., van der Zon G., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-β-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Vis Exp. 2021;(168). doi: 10.3791/62198.

Krishnamoorthi M.K., Thandavarayan R.A., Youker K.A., Bhimaraj A. An In Vitro Platform to Study Reversible Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Front Pharmacol. 2022;13:912660. doi: 10.3389/fphar.2022.912660.

Tang R., Li Q., Lv L., Dai H., Zheng M., Ma K., Liu B. Angiotensin II mediates the high-glucose-induced endothelial-to-mesenchymal transition in human aortic endothelial cells. Cardiovasc Diabetol. 2010;9:31. doi: 10.1186/1475-2840-9-31

Noseda M., McLean G., Niessen K., Chang L., Pollet I., Montpetit R., Shahidi R., Dorovini-Zis K., Li L., Beckstead B., Durand R.E., Hoodless P.A., Karsan A. Notch activation results in phenotypic and functional changes consistent with endothelial-to-mesenchymal transformation. Circ Res. 2004;94(7):910-7. doi: 10.1161/01.RES.0000124300.76171.C9.

Chang A.C., Fu Y., Garside V.C., Niessen K., Chang L., Fuller M., Setiadi A., Smrz J., Kyle A., Minchinton A., Marra M., Hoodless P.A., Karsan A. Notch initiates the endothelial-to-mesenchymal transition in the atrioventricular canal through autocrine activation of soluble guanylyl cyclase. Dev Cell. 2011;21(2):288-300. doi: 10.1016/j.devcel.2011.06.022.

Kostina A.S., Uspensky V.Е., Irtyuga O.B., Ignatieva E.V., Freylikhman O., Gavriliuk N.D., Moiseeva O.M., Zhuk S., Tomilin A., Kostareva А.А., Malashicheva A.B. Notch-dependent EMT is attenuated in patients with aortic aneurysm and bicuspid aortic valve. Biochim Biophys Acta. 2016;1862(4):733-740. doi: 10.1016/j.bbadis.2016.02.006.

Xu X., Tan X., Tampe B., Sanchez E., Zeisberg M., Zeisberg E.M. Snail Is a Direct Target of Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF1α) in Hypoxia-induced Endothelial to Mesenchymal Transition of Human Coronary Endothelial Cells. J Biol Chem. 2015;290(27):16653-64. doi: 10.1074/jbc.M115.636944.

Tang H., Babicheva A., McDermott K.M., Gu Y., Ayon R.J., Song S., Wang Z., GuptaA., Zhou T., Sun X., Dash S., Wang Z., Balistrieri A., Zheng Q., Cordery A.G., Desai A.A., Rischard F., Khalpey Z., Wang J., Black S.M., Garcia J.G.N., Makino A., Yuan J.X. Endothelial HIF-2α contributes to severe pulmonary hypertension due to endothelial-to-mesenchymal transition. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018;314(2):L256-L275. doi: 10.1152/ajplung.00096.2017.

Dejana E., Hirschi K.K., Simons M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nat Commun. 2017;8:14361. doi: 10.1038/ncomms14361.

Piera-Velazquez S., Jimenez S.A. Endothelial to Mesenchymal Transition: Role in Physiology and in the PathogenesisofHumanDiseases.PhysiolRev.2019;99(2):1281-1324. doi: 10.1152/physrev.00021.2018.

Gao Y., Galis Z.S. Exploring the Role of Endothelial Cell Resilience in Cardiovascular Health and Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):179-185. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314346.

Greenspan L.J., Weinstein B.M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):251-269. doi: 10.1007/s10456-020-09761-7.

Великанова Е.А., Кутихин А.Г., Матвеева В.Г., Тупикин А.Е., Кабилов М.Р., Антонова Л.В. Сравнение профиля генной экспрессии колониеформирующих эндотелиальных клеток из периферической крови человека и эндотелиальных клеток коронарной артерии. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020; 9(2): 74-81. doi: 10.17802/2306-1278-2020-9-2-74-81.

Velikanova E.A., Kutikhin A.G., Matveeva V.G., Tupikin A.E., Kabilov M.R., Antonova L.V. Comparison of gene expression profiles of human peripheral blood derived endothelial colony-forming cells and coronary artery endothelial cells. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2020;9(2):74-81. doi: 10.17802/2306-1278-2020-9-2-74-81.

Niklason L., Dai G. Arterial Venous Differentiation for Vascular Bioengineering. Annu Rev Biomed Eng. 2018;20:431-447. doi: 10.1146/annurev-bioeng-062117-121231.

Wolf K., Hu H., Isaji T., Dardik A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. J Vasc Surg. 2019;69(1):253-262. doi: 10.1016/j.jvs.2018.06.195.

Marziano C., Genet G., Hirschi K.K. Vascular endothelial cell specification in health and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):213-236. doi: 10.1007/s10456-021-09785-7.

Corbett A.H. Post-transcriptional regulation of gene expression and human disease. Curr Opin Cell Biol. 2018;52:96-104. doi: 10.1016/j.ceb.2018.02.011.

Evrard S.M., Lecce L., Michelis K.C., Nomura-Kitabayashi A., Pandey G., Purushothaman K.R., d'Escamard V., Li J.R., Hadri L., Fujitani K., Moreno P.R., Benard L., Rimmele P., Cohain A., Mecham B., Randolph G.J., Nabel E.G., Hajjar R., Fuster V., Boehm M., Kovacic J.C. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nat Commun. 2016;7:11853. doi: 10.1038/ncomms11853.

Yap C., MieremetA., de Vries C.J.M., Micha D., de Waard V. Six Shades of Vascular Smooth Muscle Cells Illuminated by KLF4 (Krüppel-Like Factor 4). Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(11):2693-2707. doi: 10.1161/ATVBAHA.121.316600.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.