Основные положения

kpccz

Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний

Complex Issues of Cardiovascular Diseases

2306-12782587-9537

Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”

10.17802/2306-1278-2022-11-3-162-176

kpccz-1171

Research Article

ОНЛАЙН. ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Патологическая физиология

ONLINE. ORIGINAL STUDIES. Pathological physiology

Сократительные белки сосудистых гладкомышечных клеток – универсальные маркеры сосудов микроциркуляторного русла

Vascular smooth muscle cell contractile proteins as universal markers of vessels of microcirculatory bed

https://orcid.org/0000-0003-4124-2316

Богданов

Л. А.

Bogdanov

L. A.

Богданов Лев Александрович - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Leo A. Bogdanov - Junior Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

bogdanovleone@gmail.com

https://orcid.org/0000-0002-1079-1956

Великанова

Е. А.

Velikanova

E. A.

Великанова Елена Анатольевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории клеточных технологий отдела экспериментальной медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Elena A. Velikanova - PhD, Researcher at the Laboratory for Tissue Engineering, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0003-2810-3100

Каноныкина

А. Ю.

Kanonykina

A. Yu.

Каноныкина Анастасия Юрьевна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Anastasia Yu. Kanonykina - Junior Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-1746-8895

Фролов

А. В.

Frolov

A. V.

Фролов Алексей Витальевич - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории рентгенэндоваскулярной и реконструктивной хирургии сердца и сосудов отдела хирургии сердца и сосудов.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Alexey V. Frolov - MD, PhD, Senior Researcher at the Laboratory of Reconstructive Surgery, Department of Cardiovascular Surgery, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-1518-3888

Шишкова

Д. К.

Shishkova

D. K.

Шишкова Дарья Кирилловна - кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Daria K. Shishkova - PhD, Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0002-1867-6354

Лазебная

А. И.

Lazebnaya

A. I.

Лазебная Анастасия Ивановна - младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Anastasia I. Lazebnaya - BSc, Junior Researcher at the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

https://orcid.org/0000-0001-8679-4857

Кутихин

А. Г.

Kutikhin

A. G.

Кутихин Антон Геннадьевич - кандидат медицинских наук заведующий лабораторией молекулярной, трансляционной и цифровой медицины.

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002.

Anton G. Kutikhin - MD, PhD, Head of the Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases.

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002.

Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеванийРоссияResearch Institute for Complex Issues of Cardiovascular DiseasesRussian Federation

2022

12102022

113162176

2022

Богданов Л.А., Великанова Е.А., Каноныкина А.Ю., Фролов А.В., Шишкова Д.К., Лазебная А.И., Кутихин А.Г.

Bogdanov L.A., Velikanova E.A., Kanonykina A.Y., Frolov A.V., Shishkova D.K., Lazebnaya A.I., Kutikhin A.G.

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.

https://www.nii-kpssz.com/jour/article/view/1171

Основные положения

Основные положения. Показано, что использование маркеров сосудистых гладкомышечных клеток, к примеру тяжелых цепей миозина гладких мышц (SM-MHC) и альфа-актина гладких мышц (α-SMA), для иммунодетекции сосудов микроциркуляторного русла сосудистой стенки (vasa vasorum) предпочтительнее применения эндотелиальных маркеров (CD31 и VE-кадгерин), поскольку позволяет определять сосудистую геометрию вне зависимости от артефактов пробоподготовки и обеспечивает идеальное соотношение «сигнал – шум».

За исключением эластических мембран, позволяющих дифференцировать артериолы от венул и капилляров, в тканях сосудов взрослого человека не выявлено специфичных маркеров артериальной, венозной и капиллярной дифференцировки, хотя в аортах крыс маркерами венозной дифференцировки служили транскрипционные факторы KLF2 и PROX1, а маркером капиллярной дифференцировки – транскрипционный фактор HEY1.

Цель

Цель. Разработать оптимальный способ детекции сосудов микроциркуляторного русла и оценить подходы к дифференциальному окрашиванию артериол, венул и капилляров на примере сети vasa vasorum большой подкожной вены (БПВ) человека и аорты крысы.

Материалы и методы

Материалы и методы. Для исследования использовали сегменты БПВ, извлеченные в процессе коронарного шунтирования, а также аорты нормолипидемических и нормотензивных крыс Wistar. Серийные криосрезы анализировали при помощи окрашивания гематоксилином и эозином, пентахромного окрашивания по Расселлу – Мовату, иммунофлюоресцентного окрашивания на маркеры эндотелиальных клеток (ЭК) (CD31 и VE-кадгерин), сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) (SM-MHC и α-SMA), механочувствительных транскрипционных факторов (KLF2 и KLF4), транскрипционные факторы артериальной дифференцировки (HES1, HEY1, ERG), транскрипционные факторы и маркеры венозной дифференцировки (NR2F2, NRP2), транскрипционные факторы и маркеры лимфатической дифференцировки (PROX1, LYVE1, VEGFR3), а также иммуногистохимического окрашивания на маркеры венозной дифференцировки NR2F2. Готовые микропрепараты анализировали посредством световой и конфокальной микроскопии.

Результаты

Результаты. В сравнении с маркерами ЭК (CD31 и VE-кадгерином) маркеры СГМК (SM-MHC и α-SMA) позволяли осуществлять объективную визуализацию и оценку сосудистой геометрии и обеспечивали максимальное соотношение «сигнал – шум» независимо от вида маркера, типа сосуда или антитела. Аутофлюоресценция и специфичный гистологический паттерн эластических мембран в ходе окрашивания по Расселлу – Мовату позволяли дифференцировать артериолы от остальных сосудов микроциркуляторного русла. Несмотря на то что иммуноокрашивание аорт крыс показало специфичные маркеры венозного (KLF2 и PROX1) и капиллярного (HEY1) эндотелия, данные находки не нашли подтверждения при иммуноокрашивании БПВ человека. Таким образом, специфичных маркеров венул и капилляров в тканях взрослого человека не идентифицировано, несмотря на анализ широкой палитры классических маркеров различных эндотелиальных дифферонов.

Заключение

Заключение. Для иммунодетекции сосудов микроциркуляторного русла целесообразно использовать маркеры СГМК (SM-MHC и α-SMA), а не маркеры ЭК (CD31 и VE-кадгерин). Отсутствие специфичных маркеров дифференцировки микрососудов (в частности vasa vasorum) позволяет предположить пентахромное окрашивание по Расселлу – Мовату в качестве оптимальной опции для машинного обучения нейронных сетей с целью анализа сосудов микроциркуляторного русла.

Highlights

Highlights. The use of vascular smooth muscle cell markers, e.g. smooth muscle myosin heavy chain (SM-MHC) and alpha smooth muscle actin (α-SMA) for immunodetection of adventitial and perivascular microvessels (vasa vasorum) is preferrable over endothelial markers (CD31 and VE-cadherin) as it allows to define vascular geometry regardless of sectioning artifacts and provides ideal signal-to-noise ratio.

Aside from elastic laminae which discriminate arterioles from venules and capillaries, we were unable to confirm any specific markers of arterial, venous, and capillary differentiation, although KLF2 and PROX1 transcription factors indicated venous specification and HEY1 suggested capillary identity in rat aortas.

Aim

Aim. To develop an optimal approach to detection of microvessels and to evaluate the techniques for the differential immunostaining of arterioles, venules, and capillaries in human saphenous veins and rat aortas.

Methods

Methods. Saphenous veins excised during the coronary artery bypass graft surgery were used for the study. Serial cryosections were analyzed by means of haematoxylin and eosin and Russell-Movat’s pentachrome stainings and by immunofluorescent staining for endothelial cell markers (CD31 and VE-cadherin), vascular smooth muscle cell markers (SM-MHC and α-SMA), mechanosensitive transcription factors (KLF2 and KLF4), transcription factors of arterial specification (HES1, HEY1, ERG), transcription factors and markers of venous identity (NR2F2, NRP2), and transcription factors and markers of lymphatic lineage (PROX1, LYVE1, VEGFR3). Samples were visualized by light and confocal microscopy.

Results

Results. In comparison with endothelial cell markers (CD31 and VE-cadherin), vascular smooth muscle cell markers (SM-MHC and α-SMA) permitted objective evaluation of vascular geometry and maximized signal-to-noise ratio irrespective of specific marker, microvessel specification or antibody used. Autofluorescence and specific histological pattern of elastic membranes at Russell-Movat’s pentachrome staining allowed to discriminate arterioles from venules and capillaries. Albeit immunostaining of rat aortas found specific markers of venous endothelial cells (KLF2 and PROX1) and capillary endothelial cells (HEY1), these findings have not been confirmed in saphenous veins. We were unable to find specific markers of human venules and capillaries among the saphenous vein vasa vasorum despite an extensive screening of multiple markers.

Conclusion

Conclusion. Immunodetection of microvessels (e.g., vasa vasorum) should be performed by using vascular smooth muscle cell markers (SM-MHC and α-SMA) rather than endothelial cell markers (CD31 and VE-cadherin). Lack of specific markers to discern microvessels of different lineages suggests Russell-Movat’s pentachrome staining as an optimal option for the machine learning of neural networks to analyse the microvessels including vasa vasorum.

vasa vasorumсосуды микроциркуляторного руслаCD31VE-кадгеринSM-MHCα-SMA

vasa vasorummicrovesselsCD31VE-cadherinSM-MHCα-SMA

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2021-001 «Разработка новых фармакологических подходов к экспериментальной терапии атеросклероза и комплексных цифровых решений на основе искусственного интеллекта для автоматизированной диагностики патологий системы кровообращения и определения риска летального исхода» при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках национального проекта «Наука и университеты».

References1

Boyle E.C., Sedding D.G., Haverich A. Targeting vasa vasorum dysfunction to prevent atherosclerosis. Vascul Pharmacol. 2017; 96–98: 5-10. doi: 10.1016/j.vph.2017.08.003.

Mulligan-Kehoe M.J., Simons M. Vasa vasorum in normal and diseased arteries. Circulation. 2014; 129(24): 2557–2566. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.007189.

Herbst M., Holzenbein T.J., Minnich B. Characterization of the vasa vasorum in the human great saphenous vein: a scanning electron microscopy and 3D-morphometry study using vascular corrosion casts. Microsc Microanal. 2014; 20(4): 1120–1133. doi: 10.1017/S1431927614001287.

Mollmark J.I., Park A.J., Kim J., Wang T.Z., Katzenell S., Shipman S.L., Zagorchev L.G., Simons M., Mulligan-Kehoe M.J. Fibroblast growth factor-2 is required for vasa vasorum plexus stability in hypercholesterolemic mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32: 2644–2651. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.252544.

Kwon H.M., Sangiorgi G., Ritman E.L., McKenna C., Holmes D.R.Jr., Schwartz R.S., Lerman A. Enhanced coronary vasa vasorum neovascularization in experimental hypercholesterolemia. J Clin Invest. 1998; 101: 1551–1556. doi: 10.1172/JCI1568.

Ramani P., Dungwa J.V., May M.T. LYVE1 upregulation and lymphatic invasion correlate with adverse prognostic factors and lymph node metastasis in neuroblastoma. Virchows Arch. 2012; 460(2): 183–191. doi: 10.1007/s00428-011-1190-y.

Jackson D.G., Prevo R., Clasper S., Banerji S. LYVE1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends Immunol. 2001; 22(6): 317–321. doi: 10.1016/s1471-4906(01)01936-6.

Hong Y.K., Harvey N., Noh Y.H., Schacht V., Hirakawa S., Detmar M., Oliver G. Prox1 is a master control gene in the program specifying lymphatic endothelial cell fate. Dev Dyn. 2002; 225: 351–357. doi: 10.1002/dvdy.10163.

Pusztaszeri M.P., Seelentag W., Bosman F.T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. 2006; 54(4): 385–395. doi: 10.1369/jhc.4A6514.2005.

Фролов А.В., Терехов А.А., Богданов Л.А., Мухамадияров Р.А., Кутихин А.Г. Сравнительное изучение vasa vasorum и неоинтимы в кондуитах для коронарного шунтирования. Ангиология и сосудистая хирургия.2021; 27(2):121-126. doi: 10.33529/ANGIO2021218

Frolov A.V., Terekhov A.A., Bogdanov L.A., Mukhamadiyarov R.A., Kutikhin A.G. Comparative study of vasa vasorum and neointima in conduits for coronary artery bypass grafting. Angiology and Vascular Surgery. 2021; 27(2):121–126. doi:10.33529/ANGIO2021218. (In Russian)

Kutikhin A.G., Tupikin A.E., Matveeva V.G., Shishkova D.K., Antonova L.V., Kabilov M.R., Velikanova E.A. Human Peripheral Blood-Derived Endothelial Colony-Forming Cells Are Highly Similar to Mature Vascular Endothelial Cells yet Demonstrate a Transitional Transcriptomic Signature. Cells. 2020; 9(4): 876. doi: 10.3390/cells9040876.

Sidney L.E., Branch M.J., Dunphy S.E., Dua H.S., Hopkinson A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 2014; 32(6): 1380–9. doi: 10.1002/stem.1661.

Thachil J. Dual origins and dual roles for von Willebrand factor. J Thromb Haemost. 2021; 19(1): 308–309. doi: 10.1111/jth.15152.

Богданов Л.А., Осяев Н.Ю., Богданова Ю.Д., Мухамадияров Р.А., Шабаев А.Р., Евтушенко А.В., Кутихин А.Г. Анализ топографических сценариев формирования очагов кальцификации в дисфункциональных клапанах сердца и атеросклеротических бляшках. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2021;10(3):26-33. doi: 10.17802/2306-1278-2021-10-3-26-33.

Bogdanov L.A., Osyaev N.Yu., Bogdanova Yu.D., Mukhamadiyarov R.A., Shabaev A.R., Evtushenko A.V., Kutikhin A.G. Elemental analysis of valvular and atherosclerotic calcification. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2021;10(3): 26–33. doi: 10.17802/2306-1278-2021-10-3-26-33. (In Russian)

Alarcon-Martinez L., Yilmaz-Ozcan S., Yemisci M., Schallek J., Kılıç K., Can A., Di Polo A., Dalkara T. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. Elife. 2018; 7: e34861. doi: 10.7554/eLife.34861.

Hutter-Schmid B., Humpel C. Alpha-Smooth Muscle Actin mRNA and Protein Are Increased in Isolated Brain Vessel Extracts of Alzheimer Mice. Pharmacology. 2016; 98(5-6): 251-260. doi: 10.1159/000448007.

Zambach S.A., Cai C., Helms H.C.C., Hald B.O., Dong Y., Fordsmann J.C., Nielsen R.M., Hu J., Lønstrup M., Brodin B., Lauritzen M.J. Precapillary sphincters and pericytes at first-order capillaries as key regulators for brain capillary perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021; 118(26): e2023749118. doi: 10.1073/pnas.2023749118.

Zhou H.J., Qin L., Jiang Q., Murray K.N., Zhang H., Li B., Lin Q., Graham M., Liu X., Grutzendler J., Min W. Caveolae-mediated Tie2 signaling contributes to CCM pathogenesis in a brain endothelial cell-specific Pdcd10-deficient mouse model. Nat Commun. 2021; 12(1): 504. doi: 10.1038/s41467-020-20774-0.

Jerome J.A., Wenzel S.E., Trejo Bittar H.E. Digital Imaging Analysis Reveals Reduced Alveolar α-Smooth Muscle Actin Expression in Severe Asthma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2021; 29(7): 506–512. doi: 10.1097/PAI.0000000000000926.

Yuan K., Agarwal S., Chakraborty A., Condon D.F., Patel H., Zhang S., Huang F., Mello S.A., Kirk O.I., Vasquez R., de Jesus Perez V.A. Lung Pericytes in Pulmonary Vascular Physiology and Pathophysiology. Compr Physiol. 2021; 11(3): 2227–2247. doi: 10.1002/cphy.c200027.

Yuan K., Agarwal S., Chakraborty A., Condon D.F., Patel H., Zhang S., HuangF., Mello S.A., Kirk O.I.,Vasquez R., de Jesus PerezV.A. Lung Pericytes in Pulmonary Vascular Physiology and Pathophysiology. Compr Physiol. 2021; 11(3): 2227–2247. doi: 10.1002/cphy.c200027.

Sava P., Ramanathan A., Dobronyi A., Peng X., Sun H., Ledesma-Mendoza A., Herzog E.L., Gonzalez A.L. Human pericytes adopt myofibroblast properties in the microenvironment of the IPF lung. JCI Insight. 2017;2(24):e96352. doi: 10.1172/jci.insight.96352.

Swift M.R., Pham V.N., Castranova D., Bell K., Poole R.J., Weinstein B.M. SoxF factors and Notch regulate nr2f2 gene expression during venous differentiation in zebrafish. Dev Biol. 2014; 390(2): 116–125. doi: 10.1016/j.ydbio.2014.03.018.

Chen X., Qin J., Cheng C.M., Tsai M.J., Tsai S.Y. COUP-TFII is a major regulator of cell cycle and Notch signaling pathways. Mol Endocrinol. 2012; 26(8): 1268–1277. doi: 10.1210/me.2011-1305.

Melincovici C.S., Boşca A.B., Şuşman S., Mărginean M., Mihu C., Istrate M., Moldovan I.M., Roman A.L., Mihu C.M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - key factor in normal and pathological angiogenesis. Rom J Morphol Embryol. 2018; 59(2): 455–467.

Jackson D.G. The lymphatics revisited: new perspectives from the hyaluronan receptor LYVE-1. Trends Cardiovasc Med. 2003; 13(1): 1–7. doi: 10.1016/s1050-1738(02)00189-5.

Heinolainen K., Karaman S., D'Amico G., Tammela T., Sormunen R., Eklund L., Alitalo K., Zarkada G. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circ Res. 2017; 120(9): 1414–1425. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.310477.

HeinolainenK.,KaramanS.,D'AmicoG.,TammelaT.,Sormunen R., Eklund L., Alitalo K., Zarkada G. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circ Res. 2017; 120(9): 1414–1425. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.310477.

Alghamdi A.A.A., Benwell C.J., Atkinson S.J., Lambert J., Johnson R.T., Robinson S.D. NRP2 as an Emerging Angiogenic Player; Promoting Endothelial Cell Adhesion and Migration by Regulating Recycling of α5 Integrin. Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 395. doi: 10.3389/fcell.2020.00395.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.