kpcczКомплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеванийComplex Issues of Cardiovascular Diseases2306-12782587-9537Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”10.17802/2306-1278-2022-11-4-158-166kpccz-1251Research ArticleОНЛАЙН. ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Патологическая физиологияONLINE. ORIGINAL STUDIES. Pathological physiologyОценка экспрессии провоспалительных цитокинов в гладкомышечных клетках коронарной артерии, экспонированных мутагеном алкилирующего механизма действияGene expression of proinflammatory cytokines in human coronary artery smooth muscle cells exposed to alkylating mutagenhttps://orcid.org/0000-0002-4824-2418СиницкийМ. Ю.SinitskyM. Yu.

Синицкий Максим Юрьевич, кандидат биологических наук старший научный сотрудник лаборатории геномноймедицины отдела экспериментальной медицины

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

Sinitsky Maxim Yu., PhD, Senior Researcher at the Laboratory of Genomic Medicine, Department of Experimental Medicine

 6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002

max-sinitsky@rambler.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4467-8732СиницкаяА. В.SinitskayaA. N.

Синицкая Анна Викторовна, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

Sinitskaya Anna V., PhD, Researcher at the Laboratory ofGenomic Medicine, Department of Experimental Medicine

 6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002

 

https://orcid.org/0000-0002-1518-3888ШишковаД. К.ShishkovaD. V.

Шишкова Дарья Кирилловна, кандидат биологических наук научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины отдела экспериментальной медицины

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

Shishkova Daria K., PhD, Researcher at the Laboratory ofMolecular, Translational and Digital Medicine

 6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002

 

https://orcid.org/0000-0002-9714-4080ХуторнаяМ. В.KhutornayaM. V.

Хуторная Мария Владимировна, младший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

Khutornaya Maria V., Junior Researcher at the Laboratoryof Molecular, Translational and Digital Medicine, Departmentof Experimental Medicine

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002

https://orcid.org/0000-0002-0747-2495АсановМ. А.AsanovM. A.

Асанов Максим Айдарович, младший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

Asanov Maxim A., Junior Researcher at the Laboratory of Molecular, Translational and Digital Medicine, Department of Experimental Medicine

6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002

https://orcid.org/0000-0002-3002-2863ПонасенкоА. В.PonasenkoA.  V.

Понасенко Анастасия Валериевна, кандидат медицинских наук заведующая лабораторией геномной медицины отдела экспериментальной медицины

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

Ponasenko Anastasia V., PhD, Head of the Laboratory of Molecular, Translational and Digital Medicine, Department ofExperimental Medicine

 6, Sosnoviy Blvd., Kemerovo, 650002

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»РоссияFederal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”Russian Federation202210012023114158166Copyright © Синицкий М.Ю., Синицкая А.В., Шишкова Д.К., Хуторная М.В., Асанов М.А., Понасенко А.В., 20232023Синицкий М.Ю., Синицкая А.В., Шишкова Д.К., Хуторная М.В., Асанов М.А., Понасенко А.В.Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.N., Shishkova D.V., Khutornaya M.V., Asanov M.A., Ponasenko A.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nii-kpssz.com/jour/article/view/1251

Актуальность. Известно, что повреждение ДНК гладкомышечных клеток может быть триггером их клональной экспансии и трансформации в пенистые клетки. Таким образом, изучение молекулярно-генетических механизмов ответа гладкомышечных клеток сосудов на генотоксическое воздействие представляется важным и актуальным в контексте углубленного понимания механизмов атерогенеза.Цель. Изучить характер изменения уровня мРНК и концентрации провоспалительных цитокинов IL6 и IL8 в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека, культивируемых в условиях генотоксической нагрузки.Материалы и методы. Уровень генной экспрессии изучаемых цитокинов в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в двух временных точках – непосредственно после 6 ч экспозиции клеток митомицином С (точка 1) и после 6 ч экспозиции мутагеном с последующими 24 ч культивирования клеток в чистой культуральной среде (точка 2). Контролем служили гладкомышечные клетки, культивированные по вышеуказанной схеме без генотоксической нагрузки. В качестве референсных генов использовали HPRT1, GAPDH и B2M. Уровень экспрессии генов интереса рассчитывали по методу ΔCt. Концентрацию IL6 и IL8 в культуральной среде определяли с помощью иммуноферментного анализа в точках 1 и 2. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 9.Результаты. Непосредственно после мутагенного воздействия (точка 1) не выявлено изменения уровня экспрессии генов IL6 и IL8 в гладкомышечных клетках, экспонированных митомицином С, по сравнению с неэкспонированным контролем. После удаления из культур мутагена в экспериментальной группе отмечено снижение уровня мРНК генов IL6 и IL8 по сравнению с контролем (кратность изменения экспрессии составила 0,36 и 0,67 соответственно). При этом достоверных различий концентрации изученных цитокинов в культуральной среде гладкомышечных клеток, экспонированных митомицином С, по сравнению с контролем не выявлено.Заключение. Генотоксический стресс в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека, вызванный алкилирующим мутагеном митомицином С, приводит к изменению профиля генной экспрессии, но не концентрации провоспалительных цитокинов IL6 и IL8. Таким образом, воздействие митомицина С на гладкомышечные клетки не приводит к формированию ими провоспалительного фенотипа.

Background. It is known that DNA damage in smooth muscle cells can trigger their clonal expansion and transformation into foam cells. Thus, the study of the molecular genetic mechanisms of the vascular smooth muscle cells response to genotoxic exposure is important and relevant in the context of an in-depth understanding of atherogenesis.Aim. To study mRNA level and concentration of proinflammatory cytokines IL6 and IL8 in the human coronary artery smooth muscle cells exposed to alkylating mutagen.Methods. Gene expression signature of studied cytokines in the human coronary artery smooth muscle cells was accessed by quantitative polymerase chain reaction in the two timepoints – immediately after six-hour exposure to mitomycin C (point 1) and after six-hour exposure to mitomycin C followed by 24 hours of cells being cultivated on mitomycin C-free cell growth medium (point 2). Smooth muscle cells cultured according to the above scheme without genotoxin were used as controls. HPRT1, GAPDH and B2M were used as the reference genes. Gene expression level was calculated by ΔCt method. IL6 and IL8 concentration was evaluated in the culture media in points 1 and 2 by enzyme-linked immunosorbent assay. Statistical analysis was performed in GraphPad Prism 9 software.Results. Immediately after mutagenic exposure (point 1) we discovered no significant changes in the expression level of IL6 and IL8 in the mitomycin C exposed smooth muscle cells compared to controls. Removal of mutagen increased expression of IL6 and IL8 in the experimental group (0,36- and 0,67-fold, respectively). At the same time, we discovered no significant differences in the studied cytokines concentration in the culture medium of mutagen-exposed cells compared to the nonexposed controls.Conclusion. Genotoxic stress in human coronary artery smooth muscle cells exposed to alkylating mutagen (mitomycin C) leads to differential expression but not secretion of proinflammatory cytokines IL6 and IL8. Thus, exposure of smooth muscle cells to mitomycin C do not trigger their proinflammatory phenotype. 

МутагенезАтерогенезПровоспалительные цитокиныВоспалениеГладкомышечные клеткиMutagenesisAtherogenesisProinflammatory cytokinesInflammationSmooth muscle cellsРабота выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2022-0001 «Молекулярные, клеточные и биомеханические механизмы патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний в разработке новых методов лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы на основе персонифицированной фармакотерапии, внедрения малоинвазивных медицинских изделий, биоматериалов и тканеинженерных имплантатов».ReferencesLibby P., Ridker P.M., Hansson G.K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 2011;473(7347):317-325. doi: 10.1038/nature10146.Libby P., Ridker P.M., Hansson G.K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 2011;473(7347):317-325. doi: 10.1038/nature10146.Bentzon J.F., Otsuka F., Virmani R., Falk E. Mechanisms of plaque formation and rupture. Circ Res. 2014;114(12):1852-1866. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.302721.Bentzon J.F., Otsuka F., Virmani R., Falk E. Mechanisms of plaque formation and rupture. Circ Res. 2014;114(12):1852-1866. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.302721.Pulliero A., Godschalk R., Andreassi M.G., Curfs D., Van Schooten F.J., Izzotti A. Environmental carcinogens and mutational pathways in atherosclerosis. Int J Hyg Environ Health. 2015;218(3):293-312. doi: 10.1016/j.ijheh.2015.01.007.Pulliero A., Godschalk R., Andreassi M.G., Curfs D., Van Schooten F.J., Izzotti A. Environmental carcinogens and mutational pathways in atherosclerosis. Int J Hyg Environ Health. 2015;218(3):293-312. doi: 10.1016/j.ijheh.2015.01.007.Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017;(1):92-101. doi: 10.17802/2306-1278-2017-1-92-101.Kutikhin A.G., Sinitsky M.Y., Ponasenko A.V. Role of mutagenesis in atherosclerosis. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2017;(1):92-101 (in Russian). doi: 10.17802/2306-1278-2017-1-92-101.Binková B., Smerhovský Z., Strejc P., Boubelík O., Stávková Z., Chvátalová I., Srám R.J. DNA-adducts and atherosclerosis: a study of accidental and sudden death males in the Czech Republic. Mutat Res. 2002;501(1-2):115-128. doi: 10.1016/s0027-5107(02)00019-2.Binková B., Smerhovský Z., Strejc P., Boubelík O., Stávková Z., Chvátalová I., Srám R.J. DNA-adducts and atherosclerosis: a study of accidental and sudden death males in the Czech Republic. Mutat Res. 2002;501(1-2):115-128. doi: 10.1016/s0027-5107(02)00019-2.Nair J., De Flora S., Izzotti A., Bartsch H. Lipid peroxidation-derived etheno-DNA adducts in human atherosclerotic lesions. Mutat Res. 2007;621(1-2):95-105. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2007.02.013.Nair J., De Flora S., Izzotti A., Bartsch H. Lipid peroxidation-derived etheno-DNA adducts in human atherosclerotic lesions. Mutat Res. 2007;621(1-2):95-105. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2007.02.013.GBD 2017 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018;392(10159):1736-1788. doi: 10.1016/S0140-6736(18)32203-7.GBD 2017 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018;392(10159):1736-1788. doi: 10.1016/S0140-6736(18)32203-7.Rosefort C., Fauth E., Zankl H. Micronuclei induced by aneugens and clastogens in mononucleate and binucleate cells using the cytokinesis block assay. Mutagenesis. 2004;19(4):277-284. doi: 10.1093/mutage/geh028.Rosefort C., Fauth E., Zankl H. Micronuclei induced by aneugens and clastogens in mononucleate and binucleate cells using the cytokinesis block assay. Mutagenesis. 2004;19(4):277-284. doi: 10.1093/mutage/geh028.Lorge E., Thybaud V., Aardema M.J., Oliver J., Wakata A., Lorenzon G., Marzin D. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutat Res. 2006;607(1):13-36. doi: 10.1016/j.mrgentox.2006.04.006.Lorge E., Thybaud V., Aardema M.J., Oliver J., Wakata A., 166 Экспрессия цитокинов в гладкомышечных клетках Lorenzon G., Marzin D. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutat Res. 2006;607(1):13-36. doi: 10.1016/j.mrgentox.2006.04.006.Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.Weakley S.M., Jiang J., Kougias P., Lin P.H., Yao Q., Brunicardi F.C., Gibbs R.A., Chen C. Role of somatic mutations in vascular disease formation. Expert Rev Mol Diagn. 2010;10(2):173-185. doi: 10.1586/erm.10.1.Weakley S.M., Jiang J., Kougias P., Lin P.H., Yao Q., Brunicardi F.C., Gibbs R.A., Chen C. Role of somatic mutations in vascular disease formation. Expert Rev Mol Diagn. 2010;10(2):173-185. doi: 10.1586/erm.10.1.Kirsch-Volders M., Bonassi S., Knasmueller S., Holland N., Bolognesi C., Fenech M.F. Commentary: critical questions, misconceptions and a road map for improving the use of the lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for in vivo biomonitoring of human exposure to genotoxic chemicals-a HUMN project perspective. Mutat Res. 2014;759:49-58. doi: 10.1016/j.mrrev.2013.12.001.Kirsch-Volders M., Bonassi S., Knasmueller S., Holland N., Bolognesi C., Fenech M.F. Commentary: critical questions, misconceptions and a road map for improving the use of the lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for in vivo biomonitoring of human exposure to genotoxic chemicals-a HUMN project perspective. Mutat Res. 2014;759:49-58. doi: 10.1016/j.mrrev.2013.12.001.Stone M.P., Cho Y.J., Huang H., Kim H.Y., Kozekov I.D., Kozekova A., Wang H., Minko I.G., Lloyd R.S., Harris T.M., Rizzo C.J. Interstrand DNA cross-links induced by alpha, beta-unsaturated aldehydes derived from lipid peroxidation and environmental sources. Acc Chem Res. 2008;41(7):793-804. doi: 10.1021/ar700246x.Stone M.P., Cho Y.J., Huang H., Kim H.Y., Kozekov I.D., Kozekova A., Wang H., Minko I.G., Lloyd R.S., Harris T.M., Rizzo C.J. Interstrand DNA cross-links induced by alpha, beta-unsaturated aldehydes derived from lipid peroxidation and environmental sources. Acc Chem Res. 2008;41(7):793-804. doi: 10.1021/ar700246x.Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L., Kim C.R., Lee S.H. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis. 2006;27(3):446-53. doi: 10.1093/carcin/bgi254.Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L., Kim C.R., Lee S.H. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis. 2006;27(3):446-53. doi: 10.1093/carcin/bgi254.Sinitsky M.Y., Kutikhin A.G., Tsepokina A.V., Shishkova D.K., Asanov M.A., Yuzhalin A.E., Minina V.I., Ponasenko A.V. Mitomycin C induced genotoxic stress in endothelial cells is associated with differential expression of proinflammatory cytokines. Mutat Res. 2020;858-860:503252. doi: 10.1016/j.mrgentox.2020.503252.Sinitsky M.Y., Kutikhin A.G., Tsepokina A.V., Shishkova D.K., Asanov M.A., Yuzhalin A.E., Minina V.I., Ponasenko A.V. Mitomycin C induced genotoxic stress in endothelial cells is associated with differential expression of proinflammatory cytokines. Mutat Res. 2020;858-860:503252. doi: 10.1016/j.mrgentox.2020.503252.Синицкий М.Ю., Цепокина А.В., Кутихин А.Г., Шишкова Д.К., Понасенко А.В. Профиль генной экспрессии в эндотелиальных клетках, культивируемых в присутствии митомицина C. Биомедицинская химия. 2021;67(2):130-136. doi: 0.18097/pbmc20216702130Sinitsky M.Y., Tsepokina A.V., Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Ponasenko A.V. The gene expression signature in endothelial cells exposed to mitomycin C. Biomedical Chemistry. 2021;67(2):130-136 (in Russian). doi: 10.18097/pbmc20216702130.Cai Q., Lanting L., Natarajan R. Growth factors induce monocyte binding to vascular smooth muscle cells: implications for monocyte retention in atherosclerosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2004;287:707-714. doi: 10.1152/ajpcell.00170.2004.Cai Q., Lanting L., Natarajan R. Growth factors induce monocyte binding to vascular smooth muscle cells: implications for monocyte retention in atherosclerosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2004;287:707-714. doi: 10.1152/ajpcell.00170.2004.Lim S., Park S. Role of vascular smooth muscle cell in the inflammation of atherosclerosis. BMB Rep. 2014;47(1):1-7. doi: 10.5483/bmbrep.2014.47.1.285.Lim S., Park S. Role of vascular smooth muscle cell in the inflammation of atherosclerosis. BMB Rep. 2014;47(1):1-7. doi: 10.5483/bmbrep.2014.47.1.285.Lee G.L., Chang Y.W., Wu J.Y., Wu M.L., Wu K.K., Yet S.F., Kuo C.C. TLR 2 induces vascular smooth muscle cell migration through cAMP response element-binding protein-mediated interleukin-6 production. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:2751-2760. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.300302.Lee G.L., Chang Y.W., Wu J.Y., Wu M.L., Wu K.K., Yet S.F., Kuo C.C. TLR 2 induces vascular smooth muscle cell migration through cAMP response element-binding protein-mediated interleukin-6 production. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:2751-2760. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.300302.Yang X., Coriolan D., Murthy V., Schultz K., Golenbock D.T., Beasley D. Proinflammatory phenotype of vascular smooth muscle cells: role of efficient Toll-like receptor 4 signaling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289:1069-1076. doi: 10.1152/ajpheart.00143.2005.Yang X., Coriolan D., Murthy V., Schultz K., Golenbock D.T., Beasley D. Proinflammatory phenotype of vascular smooth muscle cells: role of efficient Toll-like receptor 4 signaling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289:1069-1076. doi: 10.1152/ajpheart.00143.2005.Lee J.H., Joo J.H., Kim J., Lim H.J., Kim S., Curtiss L., Seong J.K., Cui W, Yabe-Nishimura C., Bae Y.S. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc Res. 2013;99:483-493. doi: 10.1093/cvr/cvt107.Lee J.H., Joo J.H., Kim J., Lim H.J., Kim S., Curtiss L., Seong J.K., Cui W, Yabe-Nishimura C., Bae Y.S. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc Res. 2013;99:483-493. doi: 10.1093/cvr/cvt107.Nilsson J. Cytokines and smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 1993;27(7):1184-1190. doi: 10.1093/cvr/27.7.1184.Nilsson J. Cytokines and smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 1993;27(7):1184-1190. doi: 10.1093/cvr/27.7.1184.Romano M., Sironi M., Toniatti C., Polentarutti N., Fruscella P., Ghezzi P., Faggioni R., Luini W., van Hinsbergh V., Sozzani S., Bussolino F., Poli V., Ciliberto G., Mantovani A. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment. Immunity. 1997;6(3):315-325. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80334-9.Romano M., Sironi M., Toniatti C., Polentarutti N., Fruscella P., Ghezzi P., Faggioni R., Luini W., van Hinsbergh V., Sozzani S., Bussolino F., Poli V., Ciliberto G., Mantovani A. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment. Immunity. 1997;6(3):315-325. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80334-9.Apostolakis S., Vogiatzi K., Amanatidou V., Spandidos D.A. Interleukin 8 and cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 2009;84(3):353-360. doi: 10.1093/cvr/cvp241.Apostolakis S., Vogiatzi K., Amanatidou V., Spandidos D.A. Interleukin 8 and cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 2009;84(3):353-360. doi: 10.1093/cvr/cvp241.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.