kpcczКомплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеванийComplex Issues of Cardiovascular Diseases2306-12782587-9537Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”10.17802/2306-1278-2024-13-4-126-137kpccz-1363Research ArticleАНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР. Патологическая физиологияREVIEWS. Pathological physiologyАКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ МОДЕЛИРОВАНИЯ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И МИОКАРДИАЛЬНОГО ФИБРОЗА У КРЫСCURRENT ISSUES OF MODELING HEART FAILURE AND MYOCARDIAL FIBROSIS IN RATShttps://orcid.org/0000-0003-0334-6237СмирноваЕлена АмишевнаSmirnovaElena A.

доктор медицинских наук, доцент заведующая кафедрой внутренних болезней федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Рязань, Российская Федерация

MD, PhD, Associate Professor, Head of the Department of Internal Diseases, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education “Ryazan State Medical University”, Ryazan, Russian Federation

Smirnova-EA@inbox.ruhttps://orcid.org/0000-0003-1298-5524ПономареваОльга ВладимировнаPonomarevaOlga V.

очный аспирант кафедры внутренних болезней федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Рязань, Российская Федерация

Postgraduate Student at the Department of Internal Diseases, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education “Ryazan State Medical University”, Ryazan, Russian Federation

olgaponomaryeva@yandex.ruФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской ФедерацииРоссияFederal State Budgetary Educational Institution of Higher Education “Ryazan State Medical University”Russian Federation202411012025134126137Copyright © Смирнова Е.А., Пономарева О.В., 20242024Смирнова Е.А., Пономарева О.В.Smirnova E.A., Ponomareva O.V.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nii-kpssz.com/jour/article/view/1363Основные положения

Основные положения

 

 

Аннотация

Аннотация

Для разработки новых эффективных стратегий лечения требуется подробное изучение механизмов развития сердечной недостаточности и ее основного патогенетического фактора – миокардиального фиброза. Выбор подходящей модели – ключевой шаг к надежному экспериментальному исследованию. Цель обзора – систематизировать современные данные о способах моделирования сердечной недостаточности у крыс. Основными преимуществами этих животных являются высокое биохимическое и физиологическое сходство с человеком, простота разведения, доступность и экономичность содержания, небольшие размеры тела, позволяющие при этом проводить хирургические вмешательства. В статье классифицируются доступные в настоящее время модели сердечной недостаточности на грызунах, рассматривается их патофизиологическая основа, хронология формирования сердечной недостаточности, клинические особенности, преимущества и возможные недостатки каждой экспериментальной модели. Особое внимание уделяется способам моделирования, разработанным отечественными учеными. Обсуждаются методы оценки развившегося фиброза миокарда и влияние некоторых лекарственных препаратов на его формирование. Изучение сердечной недостаточности требует надежных моделей на животных для оценки биохимических, функциональных, морфологических изменений в поврежденном миокарде, контролируемой проверки новых лекарственных препаратов. При необходимости можно использовать одновременно сразу несколько методик, тактика выбора зависит от цели планируемого исследования.

Highlights

Highlights

 

 

Annotation

Annotation

Detailed study of the mechanisms of heart failure and its main pathogenetic factor, myocardial fibrosis, is required for developing new effective treatment strategies. The choice of an appropriate model is key for a reliable experimental study. The aim of the review is to systematize current data on methods for modeling heart failure in rats. The main advantages of these animals are high genetic, biochemical and physiological similarity with humans, ease of breeding, availability of maintenance, small size, while allowing for surgery. This article classifies the currently available rat models of heart failure, discusses their pathophysiological basis, timing of the formation of heart failure, clinical features, advantages and disadvantages of each experimental model. The authors have paid particular attention to methods developed by domestic scientists. Methods for assessing the developed myocardial fibrosis and the influence of drugs on its formation are considered. The study of heart failure requires reliable animal models to assess biochemical, functional, morphological changes in damaged myocardium, and controlled testing of new drugs. Should the necessity arise, specialists should use several methods simultaneously, whereas the choice of treatment strategy depends on the aim of the study.

Сердечная недостаточностьЭкспериментальная модельЛабораторные крысыФиброз миокардаHeart failureExperimental modelLaboratory ratsMyocardial fibrosisАвторы заявляют об отсутствии финансирования исследования.ReferencesRoger V.L. Epidemiology of Heart Failure: A Contemporary Perspective. Circ Res. 2021;128(10):1421-1434. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318172.Roger V.L. Epidemiology of Heart Failure: A Contemporary Perspective. Circ Res. 2021;128(10):1421-1434. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.318172.Бойцов С.А. Хроническая сердечная недостаточность: эволюция этиологии, распространенности и смертности за последние 20 лет. Терапевтический архив. 2022;94(1):5-8. doi: 10.26442/00403660.2022.01.201317Boytsov SA. Chronic heart failure: evolution of etiology, prevalence and mortality over the past 20 years. Terapevticheskii arkhiv. 2022;94(1):5-8. doi: 10.26442/00403660.2022.01.201317 (In Russian)Ponzoni M., Coles J.G., Maynes J.T. Rodent Models of Dilated Cardiomyopathy and Heart Failure for Translational Investigations and Therapeutic Discovery. Int J Mol Sci. 2023;24(4):3162. doi: 10.3390/ijms24043162Ponzoni M., Coles J.G., Maynes J.T. Rodent Models of Dilated Cardiomyopathy and Heart Failure for Translational Investigations and Therapeutic Discovery. Int J Mol Sci. 2023;24(4):3162. doi: 10.3390/ijms24043162Wang Y., Wang M., Samuel C.S., Widdop R.E. Preclinical rodent models of cardiac fibrosis. Br J Pharmacol. 2022;179(5):882-899. doi: 10.1111/bph.15450.Wang Y., Wang M., Samuel C.S., Widdop R.E. Preclinical rodent models of cardiac fibrosis. Br J Pharmacol. 2022;179(5):882-899. doi: 10.1111/bph.15450.Farag A., Mandour A.S., Hendawy H., Elhaieg A., Elfadadny A., Tanaka R. A review on experimental surgical models and anesthetic protocols of heart failure in rats. Front Vet Sci. 2023;10:1103229. doi: 10.3389/fvets.2023.1103229.Farag A., Mandour A.S., Hendawy H., Elhaieg A., Elfadadny A., Tanaka R. A review on experimental surgical models and anesthetic protocols of heart failure in rats. Front Vet Sci. 2023;10:1103229. doi: 10.3389/fvets.2023.1103229.Katz M.G., Fargnoli A.S., Gubara S.M., Chepurko E., Bridges C.R., Hajjar R.J. Surgical and physiological challenges in the development of left and right heart failure in rat models. Heart Fail Rev. 2019;24(5):759-777. doi: 10.1007/s10741-019-09783-4Katz M.G., Fargnoli A.S., Gubara S.M., Chepurko E., Bridges C.R., Hajjar R.J. Surgical and physiological challenges in the development of left and right heart failure in rat models. Heart Fail Rev. 2019;24(5):759-777. doi: 10.1007/s10741-019-09783-4Cops J., Haesen S., De Moor B., Mullens W., Hansen D.. Current animal models for the study of congestion in heart failure: an overview. Heart Fail Rev. 2019;24(3):387-397. doi: 10.1007/s10741-018-9762-4.Cops J., Haesen S., De Moor B., Mullens W., Hansen D.. Current animal models for the study of congestion in heart failure: an overview. Heart Fail Rev. 2019;24(3):387-397. doi: 10.1007/s10741-018-9762-4.Абрамов А. А., Лакомкин В. Л., Просвирнин А. В., Капелько В.И. Характеристика давления и объема левого желудочка при диастолической и систолической дисфункции. Кардиология. 2019;59(4):45-51. doi: 10.18087/ cardio.2019.4.2647Abramov A.A., Lakomkin V.L., Prosvirnin A.V., Kapelko V.I. Pressure and Volume Characteristics of the Left Ventriclе in Its Diastolic and Systolic Dysfunction. Kardiologiia. 2019;59(4):45-51. doi: 10.18087/ cardio.2019.4.2647 (In Russian)Abbasnezhad A., Salami F., Mohebbati R. A review: Systematic research approach on toxicity model of liver and kidney in laboratory animals Animal Model Exp Med. 2022;5(5):436-444. doi: 10.1002/ame2.12230Abbasnezhad A., Salami F., Mohebbati R. A review: Systematic research approach on toxicity model of liver and kidney in laboratory animals Animal Model Exp Med. 2022;5(5):436-444. doi: 10.1002/ame2.12230Song J., Xie Q., Wang L., Lu Y., Liu P., Yang P., Chen R., Shao C., Qiao C., Wang Z., Yan J. The TIR/BB-loop mimetic AS-1 prevents Ang II-induced hypertensive cardiac hypertrophy via NF-κB dependent downregulation of miRNA-143. Sci Rep. 2019;9(1):6354. doi: 10.1038/s41598-019-42936-x.Song J., Xie Q., Wang L., Lu Y., Liu P., Yang P., Chen R., Shao C., Qiao C., Wang Z., Yan J. The TIR/BB-loop mimetic AS-1 prevents Ang II-induced hypertensive cardiac hypertrophy via NF-κB dependent downregulation of miRNA-143. Sci Rep. 2019;9(1):6354. doi: 10.1038/s41598-019-42936-x.Droogmans S., Franken P.R., Garbar C., Weytjens C., Cosyns B., Lahoutte T., Caveliers V., Pipeleers-Marichal M., Bossuyt A., Schoors D., Van Camp G. In vivo model of drug-induced valvular heart disease in rats: pergolide-induced valvular heart disease demonstrated with echocardiography and correlation with pathology. Eur Heart J. 2007;28(17):2156-62. doi: 10.1093/eurheartj/ehm263.Droogmans S., Franken P.R., Garbar C., Weytjens C., Cosyns B., Lahoutte T., Caveliers V., Pipeleers-Marichal M., Bossuyt A., Schoors D., Van Camp G. In vivo model of drug-induced valvular heart disease in rats: pergolide-induced valvular heart disease demonstrated with echocardiography and correlation with pathology. Eur Heart J. 2007;28(17):2156-62. doi: 10.1093/eurheartj/ehm263.Andersen A., van der Feen D.E., Andersen S., Schultz J.G., Hansmann G., Bogaard H.J. Animal models of right heart failure. Cardiovasc Diagn Ther. 2020;10(5):1561-1579. doi: 10.21037/cdt-20-400.Andersen A., van der Feen D.E., Andersen S., Schultz J.G., Hansmann G., Bogaard H.J. Animal models of right heart failure. Cardiovasc Diagn Ther. 2020;10(5):1561-1579. doi: 10.21037/cdt-20-400.Guo W., Zhu C., Yin Z., Zhang Y., Wang C., Walk A.S., Lin Y.H., McKinsey T.A., Woulfe K.C., Ren J., Chew H.G.Jr. The ryanodine receptor stabilizer S107 ameliorates contractility of adult Rbm20 knockout rat cardiomyocytes. Physiol Rep. 2021;9(17):e15011. doi: 10.14814/phy2.15011.Guo W., Zhu C., Yin Z., Zhang Y., Wang C., Walk A.S., Lin Y.H., McKinsey T.A., Woulfe K.C., Ren J., Chew H.G.Jr. The ryanodine receptor stabilizer S107 ameliorates contractility of adult Rbm20 knockout rat cardiomyocytes. Physiol Rep. 2021;9(17):e15011. doi: 10.14814/phy2.15011.Сарыева О.П., Кулида Л.В., Проценко Е.В., Малышева М.В. Кардиомиопатии у детей – клинические, генетические и морфологические аспекты. Российский медико-биологический вестник им. академика И.П. Павлова. 2020;28(1):99-110. doi: 10.23888/PAVLOVJ202028199-110Saryeva O.P., Kulida L.V., Protsenko E.V., Malysheva M.V. Cardiomyopathy in children – clinical, genetic and morphological aspects. I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald. 2020;28(1):99-110. doi: 10.23888/PAVLOVJ202028199-110 (In Russian)Sugihara H., Kimura K., Yamanouchi K., Teramoto N., Okano T., Daimon M., Morita H., Takenaka K., Shiga T., Tanihata J., Aoki Y., Inoue-Nagamura T., Yotsuyanagi H., Komuro I. Age-Dependent Echocardiographic and Pathologic Findings in a Rat Model with Duchenne Muscular Dystrophy Generated by CRISPR/Cas9 Genome Editing. Int Heart J. 2020;61(6):1279-1284. doi: 10.1536/ihj.20-372.Sugihara H., Kimura K., Yamanouchi K., Teramoto N., Okano T., Daimon M., Morita H., Takenaka K., Shiga T., Tanihata J., Aoki Y., Inoue-Nagamura T., Yotsuyanagi H., Komuro I. Age-Dependent Echocardiographic and Pathologic Findings in a Rat Model with Duchenne Muscular Dystrophy Generated by CRISPR/Cas9 Genome Editing. Int Heart J. 2020;61(6):1279-1284. doi: 10.1536/ihj.20-372.Черданцева Т. М., Баковецкая О. В., Никифоров А. А., Некрасова М. С.Морфологические и лабораторно-генетические исследования мышечных дистрофий. Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2021; 9(3):481–491. doi:10.23888/HMJ202193481-491Cherdantseva T.M., Bakovetskaya O.V., Nikiforov A.A., Nekrasova M.S. Morphological and laboratory genetic studies of muscular dystrophies. Science of the young (Eruditio Juvenium). 2021;9(3):481–491. doi:10.23888/HMJ202193481-491 (In Russian)Symbol report for ISCA1. HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC). Available at: https://www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/28660. (Accessed: 31.07.2023)Symbol report for ISCA1. HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC). Available at: https://www.genenames.org/data/gene-symbol-report/#!/hgnc_id/28660. (Accessed: 31.07.2023)Прошина Л.Г., Жмайлова С.В., Шевцова Л.М., Прошин А.В., Быкова О.С., Федорова Н.П., Григорьева М.В. Исследование закономерностей функционирования клеточных элементов миокарда при экспериментальной патологии сердца. Вестник Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого. 2019;115 (3):24-27. doi:10.34680/2076-8052.2019.3(115).24-27Proshina L.G., Zhmajlova S.V., Shevcova L.M., Proshin A.V., Bykova O.S., Fedorova N.P., Grigorieva M.V. Study of myocardial cell under experimental heart failure in rats. Vestnik Nov SU. 2019;115(3):24-27. doi:10.34680/2076-8052.2019.3(115).24-27 (In Russian)Инчина В.И., Столярова В.В., Гарькин Г.Г., и др. Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов. Тезисы Второго конгресса по патофизиологии. М., 2000.С. 68.Inchina V.I., Stoljarova V.V., Gar'kin G.G. et al. Sostojanie miokarda v model'noj situacii aktivacii gipertenzivnyh mehanizmov. Tezisy Vtorogo congressa popatofiziologii. Moscow; 2000. P. 68. (In Russian)Румянцева Т.А., Фатеев М.М., Федоров В.Н., Сальников Е.В., Сидоров А.В. Морфологические доказательства наличия хронической сердечной недостаточности, индуцированной у крыс методом дробного дозированного олеоторакса. Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. 2009;5:123-127.Rumjanceva T.A., Fateev M.M., Fedorov V.N., Salnikov E.V., Sidorov A.V. Morphological evidence of chronic heart failure induced by fractional dosed oleothorax in rats. Vestnik Nizhegorodskogo universitetaim. N. I. Lobachevskogo. 2009;5:123-127. (In Russian)Wang Y., Han L., Shen M., Jones E.S., Spizzo I., Walton S.L., Denton K.M., Gaspari T.A., Samuel C.S., Widdop R.E. Serelaxin and the AT2 Receptor Agonist CGP42112 Evoked a Similar, Nonadditive, Cardiac Antifibrotic Effect in High Salt-Fed Mice That Were Refractory to Candesartan Cilexetil. ACS Pharmacol Transl Sci. 2020;3(1):76-87. doi: 10.1021/acsptsci.9b00095.Wang Y., Han L., Shen M., Jones E.S., Spizzo I., Walton S.L., Denton K.M., Gaspari T.A., Samuel C.S., Widdop R.E. Serelaxin and the AT2 Receptor Agonist CGP42112 Evoked a Similar, Nonadditive, Cardiac Antifibrotic Effect in High Salt-Fed Mice That Were Refractory to Candesartan Cilexetil. ACS Pharmacol Transl Sci. 2020;3(1):76-87. doi: 10.1021/acsptsci.9b00095.Withaar C., Lam C.S.P., Schiattarella G.G., de Boer R.A., Meems L.M.G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. Eur Heart J. 2021;42(43):4420-4430. doi: 10.1093/eurheartj/ehab389Withaar C., Lam C.S.P., Schiattarella G.G., de Boer R.A., Meems L.M.G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. Eur Heart J. 2021;42(43):4420-4430. doi: 10.1093/eurheartj/ehab389Gyöngyösi M., Winkler J., Ramos I., Do Q.T., Firat H., McDonald K., González A., Thum T., Díez J., Jaisser F., Pizard A., Zannad F. Myocardial fibrosis: biomedical research from bench to bedside. Eur J Heart Fail. 2017;19(2):177-191. doi: 10.1002/ejhf.696.Gyöngyösi M., Winkler J., Ramos I., Do Q.T., Firat H., McDonald K., González A., Thum T., Díez J., Jaisser F., Pizard A., Zannad F. Myocardial fibrosis: biomedical research from bench to bedside. Eur J Heart Fail. 2017;19(2):177-191. doi: 10.1002/ejhf.696.Tao W., Yang X., Zhang Q., Bi S., Yao Z. Optimal treatment for post-MI heart failure in rats: dapagliflozin first, adding sacubitril-valsartan 2 weeks later. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1181473. doi: 10.3389/fcvm.2023.1181473Tao W., Yang X., Zhang Q., Bi S., Yao Z. Optimal treatment for post-MI heart failure in rats: dapagliflozin first, adding sacubitril-valsartan 2 weeks later. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1181473. doi: 10.3389/fcvm.2023.1181473Song R., Wang P., Yang L., Liu J., Chen Z., Ding Y. Association of FOXO3A with right ventricular myocardial fibrosis and its detection by speckle-tracking echocardiography in pulmonary hypertension. Echocardiography. 2023;40(9):958-968. doi: 10.1111/echo.15663.Song R., Wang P., Yang L., Liu J., Chen Z., Ding Y. Association of FOXO3A with right ventricular myocardial fibrosis and its detection by speckle-tracking echocardiography in pulmonary hypertension. Echocardiography. 2023;40(9):958-968. doi: 10.1111/echo.15663.JawharMamand S., Mustafa Z.A. The Impact of Dapagliflozin on Aldosterone Hormone in Rats with Heart Failure. Polytechnic Journal. 2023;12 (2):53-60. doi:10.25156/ptj.v12n2y2022.pp53-60JawharMamand S., Mustafa Z.A. The Impact of Dapagliflozin on Aldosterone Hormone in Rats with Heart Failure. Polytechnic Journal. 2023;12 (2):53-60. doi:10.25156/ptj.v12n2y2022.pp53-60Бердибеков Б.Ш., Александрова С.А., Голухова Е.З. Количественная оценка миокардиального фиброза с применением магнитно-резонансной томографии с отсроченным контрастированием при некоронарогенных желудочковых аритмиях // Креативная кардиология. 2021; 15 (3): 342–53. doi: 10.24022/1997-3187-2021-15-3-342-353Berdibekov B.Sh., Aleksandrova S.A., Golukhova E.Z. Quantification of myocardial fibrosis in patients with a nonischemic ventricular arrhythmias by late gadolinium-enhanced magnetic resonance. Creative Cardiology. 2021; 15 (3): 342–53. doi: 10.24022/1997-3187-2021-15-3-342-353 (In Rusian.)Zhu J., Chen Y., Xu Z., Wang S., Wang L., Liu X., Gao F. Non-invasive assessment of early and acute myocarditis in a rat model using cardiac magnetic resonance tissue tracking analysis of myocardial strain. Quant Imaging Med Surg. 2020;10(11):2157-2167. doi: 10.21037/qims-20-122.Zhu J., Chen Y., Xu Z., Wang S., Wang L., Liu X., Gao F. Non-invasive assessment of early and acute myocarditis in a rat model using cardiac magnetic resonance tissue tracking analysis of myocardial strain. Quant Imaging Med Surg. 2020;10(11):2157-2167. doi: 10.21037/qims-20-122.Schneider J.E., Lanz T., Barnes H., Medway D., Stork L.A., Lygate C.A., Smart S., Griswold M.A., Neubauer S. Ultra-fast and accurate assessment of cardiac function in rats using accelerated MRI at 9.4 Tesla. Magn Reson Med. 2008;59(3):636-41. doi: 10.1002/mrm.21491.Schneider J.E., Lanz T., Barnes H., Medway D., Stork L.A., Lygate C.A., Smart S., Griswold M.A., Neubauer S. Ultra-fast and accurate assessment of cardiac function in rats using accelerated MRI at 9.4 Tesla. Magn Reson Med. 2008;59(3):636-41. doi: 10.1002/mrm.21491.Qi Y., Chen Z., Guo B., Liu Z., Wang L., Liu S., Xue L., Ma M., Yin Y., Li Y., Liu G. Speckle-tracking echocardiography provides sensitive measurements of subtle early alterations associated with cardiac dysfunction in T2DM rats. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):266. doi: 10.1186/s12872-023-03239-2.Qi Y., Chen Z., Guo B., Liu Z., Wang L., Liu S., Xue L., Ma M., Yin Y., Li Y., Liu G. Speckle-tracking echocardiography provides sensitive measurements of subtle early alterations associated with cardiac dysfunction in T2DM rats. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):266. doi: 10.1186/s12872-023-03239-2.Sabatino J., De Rosa S., Tammè L., Iaconetti C., Sorrentino S., Polimeni A., Mignogna C., Amorosi A., Spaccarotella C., Yasuda M., Indolfi C. Empagliflozin prevents doxorubicin-induced myocardial dysfunction. Cardiovasc Diabetol. 2020;19(1):66. doi: 10.1186/s12933-020-01040-5.Sabatino J., De Rosa S., Tammè L., Iaconetti C., Sorrentino S., Polimeni A., Mignogna C., Amorosi A., Spaccarotella C., Yasuda M., Indolfi C. Empagliflozin prevents doxorubicin-induced myocardial dysfunction. Cardiovasc Diabetol. 2020;19(1):66. doi: 10.1186/s12933-020-01040-5.Ulusan S., Gülle K., Peynirci A., Sevimli M., Karaibrahimoglu A., Kuyumcu M.S. Dapagliflozin May Protect Against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity. Anatol J Cardiol. 2023 ;27(6):339-347. doi: 10.14744/AnatolJCardiol.2023.2825.Ulusan S., Gülle K., Peynirci A., Sevimli M., Karaibrahimoglu A., Kuyumcu M.S. Dapagliflozin May Protect Against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity. Anatol J Cardiol. 2023 ;27(6):339-347. doi: 10.14744/AnatolJCardiol.2023.2825.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.