младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины отдела экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация
Junior Researcher, Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Department of Experimental Medicine, Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”, Kemerovo, Russian Federation
младший научный сотрудник лаборатории молекулярной, трансляционной и цифровой медицины отдела экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация
Junior Researcher, Laboratory for Molecular, Translational, and Digital Medicine, Department of Experimental Medicine, Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”, Kemerovo, Russian Federation
доктор медицинских наук заведующий отделом экспериментальной медицины федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», Кемерово, Российская Федерация
PhD, MD, Head of the Department of Experimental Medicine, Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”, Kemerovo, Russian Federation
Основные положения
Цель. Провести сравнение объективности окрашивания конститутивных белков и общего белка как двух методик для нормализации сигнала при иммуноблоттинге белков эндотелиальных клеток (ЭК) и кровеносных сосудов.
Материал и методы. В бис-трис-гель для электрофореза вносили серийные разведения лизата культур ЭК или гомогената кровеносных сосудов (1, 2, 4, 8, 16 и 32 мкг белка). Окрашивание конститутивных белков ЭК (CD31/PECAM1, β-актина, β-тубулина, GAPDH, TBP, PCNA, гистона H3 и COX4) детектировали с использованием вторичных антител, конъюгированных с флюорофорами 680RD и 800CW (флюоресцентная детекция) либо с пероксидазой хрена (хемилюминесцентная детекция). Визуализацию общего белка проводили при помощи красителей Acid Black 1, Fast Green FCF, Понсо S, Конго красного, нигрозина, красителя Revert 700 и 2,2,2-трихлорэтанола.
Результаты. При окрашивании общего белка из лизата культур ЭК или гомогената кровеносных сосудов на мембранах из поливинилиденфторида и нитроцеллюлозы наиболее высокую чувствительность продемонстрировали краситель Acid Black 1 и Fast Green FCF (позволявшие детектировать ≥ 1 мкг белка), которые были выбраны для последующего сравнения. При анализе экспрессии конститутивных белков ЭК и кровеносных сосудов наиболее высокая чувствительность была выявлена при окрашивании антителами к β-актину (≥ 1–2 мкг белка), TBP (≥ 2–4 мкг белка) и PCNA (≥ 4 мкг белка). Чувствительность окрашивания общего белка превысила чувствительность окрашивания антителами к β-актину и TBP (за счет более высокой интенсивности полос). Сплошной анализ результатов окрашивания общего белка выявил максимальный и медианный коэффициент вариации при анализе лизата культур ЭК в ≈ 20% и ≈ 12% соответственно, при анализе гомогената кровеносных сосудов – в ≈ 40% и ≈ 17%.
Заключение. Наиболее чувствительным красителем для окрашивания общего белка в лизате культур ЭК и гомогенате кровеносных сосудов является Acid Black 1, цитоплазматическим конститутивным белком – β-актин, ядерным конститутивным белком – TBP. При нормализации специфичного сигнала от антител целесообразно применять окрашивание на общий белок при коэффициенте вариации ≤ 20% (для лизата культур ЭК) или ≤ 25% (для гомогената кровеносных сосудов).
Highlights
Aim. To compare the sensitivity of housekeeping proteins and total protein staining for the signal normalisation during Western blotting of endothelial cell (EC) lysate and vascular homogenate.
Methods. Serial dilutions of EC lysate or vascular homogenate (1, 2, 4, 8, 16, and 32 µg protein) were loaded into bis-tris polyacrylamide gel and stained for EC housekeeping proteins: platelet endothelial cell adhesion molecule 1 (CD31/PECAM1), β-actin, β-tubulin, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), TATA-binding protein (TBP), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), histone H3, and cytochrome c oxidase subunit 4 (COX4). Housekeeping protein expression was detected using secondary antibodies conjugated with 680RD and 800CW fluorophores or horseradish peroxidase. Total protein staining was performed using Acid Black 1, Fast Green FCF, Ponceau S, Congo Red, nigrosine, Revert 700, and 2,2,2-trichloroethanol.
Results. Acid Black 1 and Fast Green FCF were the most sensitive (≥ 1 µg protein) dyes for total protein staining in EC lysate or vascular homogenate on polyvinylidene fluoride or nitrocellulose membranes. Among the housekeeping proteins of EC lysate and vascular homogenate, the highest sensitivity was detected for β-actin (≥ 1–2 µg protein), TBP (≥ 2–4 µg protein), and PCNA (≥ 4 µg protein). Total protein staining was more sensitive than β-actin or TBP staining. Total protein staining of EC protein lysate showed maximum and median coefficient of variation of ≈ 20% and ≈ 12% for the EC lysate and ≈ 40% and ≈ 17% for vascular homogenate.
Conclusion. The most sensitive dye for total protein staining in EC lysate and vascular homogenate is Acid Black 1, the most sensitive cytoplasmic housekeeping protein is β-actin, and the most sensitive nuclear housekeeping protein is TATA-binding protein (TBP). For the respective normalization, total protein staining can be employed if coefficient of variation is ≤ 20% (for EC lysate) or ≤ 25% (for vascular homogenate).
The authors declare that there are no conflicts of interest present.