kpcczКомплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеванийComplex Issues of Cardiovascular Diseases2306-12782587-9537Federal State Budgetary Institution “Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases”10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20kpccz-753Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯORIGINAL STUDIESПараметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакцииPrimer parameters defining efficiency and coefficient of determination in quantitative polymerase chain reactionhttps://orcid.org/0000-0003-4124-2316БогдановЛ. А.BogdanovL. A.

младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

junior researcher at the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology,

6, Sosonoviy Blvd., Kemerovo, 650002

bogdanovleone@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0002-1518-3888ШишковаД. К.ShishkovaD. K.

младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

junior researcher at the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology,

6, Sosonoviy Blvd., Kemerovo, 650002

https://orcid.org/0000-0002-4824-2418СиницкийМ. Ю.SinitskyM. Yu.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

PhD, senior researcher at the Laboratory for Genomic Medicine, Division of Experimental and Clinical Cardiology,

6, Sosonoviy Blvd., Kemerovo, 650002

https://orcid.org/0000-0001-8679-4857КутихинА. Г.KutikhinA. G.

кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002

MD, PhD, Head of the Laboratory for Vascular Biology, Division of Experimental and Clinical Cardiology,

6, Sosonoviy Blvd., Kemerovo, 650002

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»РоссияResearch Institute for Complex Issues of Cardiovascular DiseasesRussian Federation202026092020931320Copyright © Богданов Л.А., Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Кутихин А.Г., 20202020Богданов Л.А., Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Кутихин А.Г.Bogdanov L.A., Shishkova D.K., Sinitsky M.Y., Kutikhin A.G.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.nii-kpssz.com/jour/article/view/753

Проведен корреляционный анализ параметров праймеров и эффективности и коэффициента детерминации кПЦР на двух независимых массивах экспериментальных данных.

При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Цель

Цель. Выявить, существует ли корреляция между параметрами праймеров, эффективностью и коэффициентом детерминации количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).

Материалы и методы

Материалы и методы. Выделение РНК производили из первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии с последующим синтезом одноцепочечной комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции. Методом кПЦР с детекцией результата в режиме реального времени (флуоресцентный краситель SYBR Green I) определяли экспрессию следующих генов: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Праймеры разработаны в программе Primer-BLAST. Корреляционный анализ по Спирмену выполнен в программе GraphPad Prism.

Результаты

Результаты. Коэффициент детерминации коррелировал с количественной оценкой качества праймеров, разработанных в программе Beacon Designer, температурой плавления ампликона и содержанием гуанина – цитозина в обратном праймере. Эффективность кПЦР, напротив, не коррелировала с количественной оценкой качества созданных в Beacon Designer праймеров, но коррелировала с длиной, а также процентным содержанием GC в обратных праймерах. Все указанные коэффициенты корреляции находились в диапазоне от 0,4 до 0,5 либо от -0,4 до -0,5, отражая корреляционную связь средней силы. В то же время остальные параметры (как для пар, так и отдельно прямого и обратного праймеров) не влияли на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Заключение При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР. 

We performed a correlation analysis between primer parameters and qPCR efficiency/coefficient of determination in two independent samples from in vitro functional experiments.

Primer parameters do not define qPCR efficiency and coefficient of determination significantly if primers are designed according to the optimised PRIMER-BLAST settings.

Aim

Aim. To find the correlation between the primer parameters, efficiency, and coefficient of determination (R2 ) in quantitative polymerase chain reaction (qPCR) conditions.

Methods

Methods. Upon RNA isolation from primary human coronary artery endothelial cells, we performed reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) utilising SYBR Green chemistry to measure the expression of the following genes: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Primers were designed employing Primer-BLAST software using optimised settings. For the correlation analysis, Spearman's rank correlation coefficient was applied (GraphPad Prism).

Results

Results. Coefficient of determination correlated with the primer pair rating by Beacon Designer, amplicon melting temperature, and GC content in the reverse primer. Reaction efficiency did not correlate with the Beacon Designer rating, yet being associated with length and GC content of the reverse primer. Abovementioned correlation coefficients ranged from 0.4 to 0.5 or from -0.4 to -0.5 indicative of moderate positive or negative correlation. Other parameters did not affect reaction efficiency and coefficient of determination. Conclusion Primer parameters do not define qPCR efficiency and coefficient of determination significantly if primers are designed according to the optimised PRIMER-BLAST settings. 

кПЦРампликондизайн праймеровэффективность кПЦРкоэффициент детерминацииqPCRAmpliconPrimer designEfficiencyCoefficient of determinationРабота выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0546-2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».ReferencesChuang, L.-Y., Cheng, Y.-H., Yang, C.-H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 2013;35(10): 1541–1549. doi:10.1007/s10529-013-1249-8Chuang, L.-Y., Cheng, Y.-H., Yang, C.-H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 2013;35(10): 1541–1549. doi:10.1007/s10529-013-1249-8SantaLucia J. Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design. Methods Mol Biol. 2007; 402:3-34. doi: 10.1007/978-1-59745-528-2_1SantaLucia J. Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design. Methods Mol Biol. 2007; 402:3-34. doi: 10.1007/978-1-59745-528-2_1Valones M.A., Guimarães R.L., Brandão L.A., de Souza P.R., de Albuquerque Tavares Carvalho A., Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: A review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1–11.Valones M.A., Guimarães R.L., Brandão L.A., de Souza P.R., de Albuquerque Tavares Carvalho A., Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: A review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1–11Ando W., Kikuchi K., Uematsu T., Yokomori H., Takaki T., Sogabe M., Kohgo Y., Otori K., Ishikawa S., Okazaki I. Novel breast cancer screening: combined expression of miR-21 and MMP-1 in urinary exosomes detects 95% of breast cancer without metastasis. Sci Rep. 2019; 9(1):13595. doi: 10.1038/s41598-019-50084-5Ando W., Kikuchi K., Uematsu T., Yokomori H., Takaki T., Sogabe M., Kohgo Y., Otori K., Ishikawa S., Okazaki I. Novel breast cancer screening: combined expression of miR-21 and MMP-1 in urinary exosomes detects 95% of breast cancer without metastasis. Sci Rep. 2019; 9(1):13595. doi: 10.1038/s41598-019-50084-5Fretzayas A., Moustaki M., Liapi O., Karpathios T. Gilbert syndrome. Eur J Pediatr. 2012; 171(1):11-5. doi: 10.1007/s00431-011-1641-0Fretzayas A., Moustaki M., Liapi O., Karpathios T. Gilbert syndrome. Eur J Pediatr. 2012; 171(1):11-5. doi: 10.1007/s00431-011-1641-0Liu Y., Guo Y., Jin X., Mei S., Xie T., Lan Q., Fang Y., Zhu B. Developmental validation study of a 24-plex Y-STR direct amplification system for forensic application. Int J Legal Med. 2019. doi: 10.1007/s00414-019-02220-zLiu Y., Guo Y., Jin X., Mei S., Xie T., Lan Q., Fang Y., Zhu B. Developmental validation study of a 24-plex Y-STR direct amplification system for forensic application. Int J Legal Med. 2019. doi: 10.1007/s00414-019-02220-zMeienberg J., Bruggmann R., Oexle K., Matyas G. Clinical sequencing: is WGS the better WES? Hum Genet. 2016;135(3):359- 62. doi: 10.1007/s00439-015-1631-9.Meienberg J., Bruggmann R., Oexle K., Matyas G. Clinical sequencing: is WGS the better WES? Hum Genet. 2016;135(3):359-62. doi: 10.1007/s00439-015-1631-9.Cankar K., Stebih D., Dreo T., Zel J., Gruden K. Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol. 2006; 6:37. doi: 10.1186/1472-6750-6-37.Cankar K., Stebih D., Dreo T., Zel J., Gruden K. Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol. 2006; 6:37. doi: 10.1186/1472-6750-6-37.Bustin S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19–28. doi:10.1016/j.bdq.2017.11.001Bustin S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19–28. doi:10.1016/j.bdq.2017.11.001Li K., Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010; 630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18Li K., Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010; 630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18Robertson J.M., Walsh-Weller J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions. Methods Mol. Biol. 1998; 98:121–154. doi: 10,1385/0-89603-443-7:121Robertson J.M., Walsh-Weller J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions. Methods Mol. Biol. 1998; 98:121–154. doi: 10,1385/0-89603-443-7: 121Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017; 6 (1): 92-101.Kutikhin A.G., Sinitsky M.Y., Ponasenko A.V. The role of mutagenesis in atherosclerosis. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2017; 6 (1): 92-101. (In Russian) 13. Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J.J., Andrade M.J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275:31-56. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J.J., Andrade M.J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275:31-56. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3Thornton B., Basu C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 2011;39(2):145-54. doi: 10.1002/bmb.20461Thornton B., Basu C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 2011;39(2):145-54. doi: 10.1002/bmb.20461Picard-Meyer E., de Garam C., Peytavin, Schereffer J.L., Marchal C., Robardet E., Cliquet F. Cross-platform evaluation of commercial real-time SYBR green RT-PCR kits for sensitive and rapid detection of European bat Lyssavirus type 1. BioMed Res. Int. 2015; 2015:839518. doi: 10.1155/2015/839518Picard-Meyer E., de Garam C., Peytavin, Schereffer J.L., Marchal C., Robardet E., Cliquet F. Cross-platform evaluation of commercial real-time SYBR green RT-PCR kits for sensitive and rapid detection of European bat Lyssavirus type 1. BioMed Res. Int. 2015; 2015:839518. doi: 10.1155/2015/839518Alemayehu S., Feghali K.C., Cowden J., Komisar J., Ockenhouse C.F., Kamau E. Comparative evaluation of published real-time PCR assays for the detection of malaria following MIQE guidelines. Malar. J. 2013; 12:277. doi: 10.1186/1475-2875-12-277Alemayehu S., Feghali K.C., Cowden J., Komisar J., Ockenhouse C.F., Kamau E. Comparative evaluation of published real-time PCR assays for the detection of malaria following MIQE guidelines. Malar. J. 2013; 12:277. doi: 10.1186/1475-2875-12-277Buzard G.S., Baker D., Wolcott M.J., Norwood D.A., Dauphin L.A. Multi-platform comparison of ten commercial master mixes for probe-based real-time polymerase chain reaction detection of bioterrorism threat agents for surge preparedness. Forensic Sci. Int. 2012; 223:292–297. doi: 10.1016/j.forsciint.2012.10.003Buzard G.S., Baker D., Wolcott M.J., Norwood D.A., Dauphin L.A. Multi-platform comparison of ten commercial master mixes for probe-based real-time polymerase chain reaction detection of bioterrorism threat agents for surge preparedness. Forensic Sci. Int. 2012; 223:292–297. doi: 10.1016/j.forsciint.2012.10.003D’haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18–24.D’haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18–24.D’haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18–24.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.