Случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода в культуре первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека

Основные положения. Спонтанный эндотелиально-мезенхимальный переход первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека характеризуется многократным повышением уровня экспрессии генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, полной потерей экспрессии маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки (CD31/PECAM1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG), ярко выраженной экспрессией генов маркеров мезенхимальной дифференцировки (фибробласт-специфичного белка и альфа-актина гладких мышц) и выраженным синтезом основного компонента внеклеточного матрикса коллагена I типа. Оптимальным алгоритмом определения эндотелиально-мезенхимального перехода является определение транскрипции генов эндотелиальной дифференцировки (PECAM1, CDH5, VWF, ERG), генов транскрипционных факторов SNAI2 и TWIST1, генов мезенхимальной дифференцировки (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) с последующей верификацией отрицательной экспрессии маркеров эндотелиального фенотипа и положительной экспрессии коллагена I типа внутри клеток посредством иммуно-флюоресцентного окрашивания.

Цель. На основании случая спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода разработать алгоритм и предложить инструменты для его детекции in vitro.

Материалы и методы. В эксперимент включены две серии первичных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC): первая серия – классический эндотелиальный морфотип, вторая – спонтанно подвергшиеся эндотелиально-мезенхимальному переходу. В качестве отрицательного контроля (клетки с эндотелиальным морфотипом) также использованы первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (HCAEC) и первичные эндотелиальные клетки внутренней грудной артерии человека (HITAEC). Оценку молекулярного профиля клеток проводили методами количественной полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции, иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного окрашивания с последующей конфокальной микроскопией.

Результаты. В отличие от HUVEC с физиологическим профилем молекулярной экспрессии, а также артериальных эндотелиальных клеток HUVEC в состоянии эндотелиально-мезенхимального перехода характеризовались потерей экспрессии генов маркеров и транскрипционных факторов эндотелиальной дифференцировки  (PECAM1,  CDH5,  VWF,  ERG),  многократно  повышенной экспрессией генов двух транскрипционных факторов перехода (SNAI2, TWIST1), приобретением экспрессии генов маркеров клеток мезенхимального ряда (FAP, S100A4, ACTA2) и генов маркеров активности синтеза компонентов внеклеточного матрикса (COL1A1, COL1A2) при сохраненной экспрессии генов общесосудистых маркеров (HES1, NRP1). Отсутствие экспрессии генов специфичных сократительных маркеров (тяжелой цепи миозина гладких мышц (MYH11) и смузелина (SMTN)) в сочетании с приобретенной экспрессией гена менее специфичного сократительного маркера альфа-актина гладких мышц (ACTA2) свидетельствовало о фенотипической схожести трансформированных клеток с миофибробластами, а не c сосудистыми гладкомышечными клетками сократительного фенотипа. Анализ белковой экспрессии методом иммуноблоттинга подтвердил потерю экспрессии эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM1, VE-кадгерин/CDH5, ERG) и продемонстрировал сохранность экспрессии вышеуказанных общесосудистых маркеров. Отсутствие иммунофлюоресцентного свечения эндотелиальных маркеров (CD31/PECAM-1, VE-кадгерина, транскрипционного фактора ERG) в сочетании с интенсивным внутриклеточным свечением основного синтезируемого белка межклеточного матрикса – коллагена I типа – также подтвердило реализацию транскрипционной программы эндотелиально-мезенхимального перехода.

Заключение. Алгоритм оценки эндотелиально-мезенхимального перехода подразумевает измерение экспрессии генов PECAM1, CDH5, VWF, ERG, SNAI2, TWIST1, FAP, S100A4, ACTA2, COL1A1 и COL1A2, комбинированное с иммунофлюоресцентным окрашиванием на CD31/PECAM-1, VE-кадгерин и транскрипционный фактор ERG в сочетании с окрашиванием на коллаген I типа.

1. Li Y., Lui K.O., Zhou B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nat Rev Cardiol. 2018;15(8):445-456. doi: 10.1038/s41569-018-0023-y.

2. Kovacic J.C., Dimmeler S., Harvey R.P., Finkel T.,Aikawa E., Krenning G., Baker A.H. Endothelial to Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease: JACC State-of-the-Art Review. J Am Coll Cardiol. 2019;73(2):190-209. doi: 10.1016/j.jacc.2018.09.089.

3. Chen P.Y., Schwartz M.A., Simons M. Endothelial-to-Mesenchymal Transition, Vascular Inflammation, and Atherosclerosis. Front Cardiovasc Med. 2020;7:53. doi: 10.3389/fcvm.2020.00053.

4. Alvandi Z., Bischoff J. Endothelial-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(9):2357-2369. doi: 10.1161/ATVBAHA.121.313788.

5. Peng Q., Shan D., Cui K., Li K., Zhu B., Wu H., Wang B., Wong S., Norton V., Dong Y., Lu Y.W., Zhou C., Chen H. The Role of Endothelial-to-Mesenchymal Transition in Cardiovascular Disease. Cells. 2022;11(11):1834. doi: 10.3390/cells11111834.

6. Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Velikanova E.A., Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Markova V.E. Endothelial Dysfunction in the Context of Blood-Brain Barrier Modeling. J Evol Biochem Physiol. 2022;58(3):781-806. doi: 10.1134/S0022093022030139.

7. Kutikhin A.G., Tupikin A.E., Matveeva V.G., Shishkova D.K., Antonova L.V., Kabilov M.R., Velikanova E.A. Human Peripheral Blood-Derived Endothelial Colony-Forming Cells Are Highly Similar to Mature Vascular Endothelial Cells yet Demonstrate a Transitional Transcriptomic Signature. Cells. 2020;9(4):876. doi: 10.3390/cells9040876.

8. Ханова М.Ю., Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Кривкина Е.О., Глушкова Т.В., Севостьянова В.В., Кутихин А.Г., Антонова Л.В. Формирование монослоя эндотелиальных клеток на поверхности сосудистого протеза малого диаметра в условиях потока. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2021. Т. 23. № 3. С. 101-114. doi: 10.15825/1995-1191-2021-3-101-114.

9. Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., Shabaev A.R., Frolov A.V., Stasev A.N., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. EMbedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy: A Detailed Protocol for the Whole-Specimen, High-Resolution Analysis of Cardiovascular Tissues. Front Cardiovasc Med. 2021;8:739549. doi: 10.3389/fcvm.2021.739549.

10. Ma J., Sanchez-Duffhues G., Goumans M.J., Ten Dijke P. TGF-β-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition in Disease and Tissue Engineering. Front Cell Dev Biol. 2020;8:260. doi: 10.3389/fcell.2020.00260.

11. Ma J., van der Zon G., Gonçalves M.A.F.V., van Dinther M., Thorikay M., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-β-Induced Endothelial to Mesenchymal Transition Is Determined by a Balance Between SNAIL and ID Factors. Front Cell Dev Biol. 2021;9:616610. doi: 10.3389/fcell.2021.616610.

12. Ma J., van der Zon G., Sanchez-Duffhues G., Ten Dijke P. TGF-β-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Vis Exp. 2021;(168). doi: 10.3791/62198.

13. Krishnamoorthi M.K., Thandavarayan R.A., Youker K.A., Bhimaraj A. An In Vitro Platform to Study Reversible Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Front Pharmacol. 2022;13:912660. doi: 10.3389/fphar.2022.912660.

14. Tang R., Li Q., Lv L., Dai H., Zheng M., Ma K., Liu B. Angiotensin II mediates the high-glucose-induced endothelial-to-mesenchymal transition in human aortic endothelial cells. Cardiovasc Diabetol. 2010;9:31. doi: 10.1186/1475-2840-9-31

15. Noseda M., McLean G., Niessen K., Chang L., Pollet I., Montpetit R., Shahidi R., Dorovini-Zis K., Li L., Beckstead B., Durand R.E., Hoodless P.A., Karsan A. Notch activation results in phenotypic and functional changes consistent with endothelial-to-mesenchymal transformation. Circ Res. 2004;94(7):910-7. doi: 10.1161/01.RES.0000124300.76171.C9.

16. Chang A.C., Fu Y., Garside V.C., Niessen K., Chang L., Fuller M., Setiadi A., Smrz J., Kyle A., Minchinton A., Marra M., Hoodless P.A., Karsan A. Notch initiates the endothelial-to-mesenchymal transition in the atrioventricular canal through autocrine activation of soluble guanylyl cyclase. Dev Cell. 2011;21(2):288-300. doi: 10.1016/j.devcel.2011.06.022.

17. Kostina A.S., Uspensky V.Е., Irtyuga O.B., Ignatieva E.V., Freylikhman O., Gavriliuk N.D., Moiseeva O.M., Zhuk S., Tomilin A., Kostareva А.А., Malashicheva A.B. Notch-dependent EMT is attenuated in patients with aortic aneurysm and bicuspid aortic valve. Biochim Biophys Acta. 2016;1862(4):733-740. doi: 10.1016/j.bbadis.2016.02.006.

18. Xu X., Tan X., Tampe B., Sanchez E., Zeisberg M., Zeisberg E.M. Snail Is a Direct Target of Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF1α) in Hypoxia-induced Endothelial to Mesenchymal Transition of Human Coronary Endothelial Cells. J Biol Chem. 2015;290(27):16653-64. doi: 10.1074/jbc.M115.636944.

19. Tang H., Babicheva A., McDermott K.M., Gu Y., Ayon R.J., Song S., Wang Z., GuptaA., Zhou T., Sun X., Dash S., Wang Z., Balistrieri A., Zheng Q., Cordery A.G., Desai A.A., Rischard F., Khalpey Z., Wang J., Black S.M., Garcia J.G.N., Makino A., Yuan J.X. Endothelial HIF-2α contributes to severe pulmonary hypertension due to endothelial-to-mesenchymal transition. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018;314(2):L256-L275. doi: 10.1152/ajplung.00096.2017.

20. Dejana E., Hirschi K.K., Simons M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nat Commun. 2017;8:14361. doi: 10.1038/ncomms14361.

21. Piera-Velazquez S., Jimenez S.A. Endothelial to Mesenchymal Transition: Role in Physiology and in the PathogenesisofHumanDiseases.PhysiolRev.2019;99(2):1281-1324. doi: 10.1152/physrev.00021.2018.

22. Gao Y., Galis Z.S. Exploring the Role of Endothelial Cell Resilience in Cardiovascular Health and Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):179-185. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314346.

23. Greenspan L.J., Weinstein B.M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):251-269. doi: 10.1007/s10456-020-09761-7.

24. Великанова Е.А., Кутихин А.Г., Матвеева В.Г., Тупикин А.Е., Кабилов М.Р., Антонова Л.В. Сравнение профиля генной экспрессии колониеформирующих эндотелиальных клеток из периферической крови человека и эндотелиальных клеток коронарной артерии. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020; 9(2): 74-81. doi: 10.17802/2306-1278-2020-9-2-74-81.

25. Niklason L., Dai G. Arterial Venous Differentiation for Vascular Bioengineering. Annu Rev Biomed Eng. 2018;20:431-447. doi: 10.1146/annurev-bioeng-062117-121231.

26. Wolf K., Hu H., Isaji T., Dardik A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. J Vasc Surg. 2019;69(1):253-262. doi: 10.1016/j.jvs.2018.06.195.

27. Marziano C., Genet G., Hirschi K.K. Vascular endothelial cell specification in health and disease. Angiogenesis. 2021;24(2):213-236. doi: 10.1007/s10456-021-09785-7.

28. Corbett A.H. Post-transcriptional regulation of gene expression and human disease. Curr Opin Cell Biol. 2018;52:96-104. doi: 10.1016/j.ceb.2018.02.011.

29. Evrard S.M., Lecce L., Michelis K.C., Nomura-Kitabayashi A., Pandey G., Purushothaman K.R., d'Escamard V., Li J.R., Hadri L., Fujitani K., Moreno P.R., Benard L., Rimmele P., Cohain A., Mecham B., Randolph G.J., Nabel E.G., Hajjar R., Fuster V., Boehm M., Kovacic J.C. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nat Commun. 2016;7:11853. doi: 10.1038/ncomms11853.

30. Yap C., MieremetA., de Vries C.J.M., Micha D., de Waard V. Six Shades of Vascular Smooth Muscle Cells Illuminated by KLF4 (Krüppel-Like Factor 4). Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(11):2693-2707. doi: 10.1161/ATVBAHA.121.316600.