Сократительные белки сосудистых гладкомышечных клеток – универсальные маркеры сосудов микроциркуляторного русла

Основные положения. Показано, что использование маркеров сосудистых гладкомышечных клеток, к примеру тяжелых цепей миозина гладких мышц (SM-MHC) и альфа-актина гладких мышц (α-SMA), для иммунодетекции сосудов микроциркуляторного русла сосудистой стенки (vasa vasorum) предпочтительнее применения эндотелиальных маркеров (CD31 и VE-кадгерин), поскольку позволяет определять сосудистую геометрию вне зависимости от артефактов пробоподготовки и обеспечивает идеальное соотношение «сигнал – шум».

За исключением эластических мембран, позволяющих дифференцировать артериолы от венул и капилляров, в тканях сосудов взрослого человека не выявлено специфичных маркеров артериальной, венозной и капиллярной дифференцировки, хотя в аортах крыс маркерами венозной дифференцировки служили транскрипционные факторы KLF2 и PROX1, а маркером капиллярной дифференцировки – транскрипционный фактор HEY1.

Цель. Разработать оптимальный способ детекции сосудов микроциркуляторного русла и оценить подходы к дифференциальному окрашиванию артериол, венул и капилляров на примере сети vasa vasorum большой подкожной вены (БПВ) человека и аорты крысы.

Материалы и методы. Для исследования использовали сегменты БПВ, извлеченные в процессе коронарного шунтирования, а также аорты нормолипидемических и нормотензивных крыс Wistar. Серийные криосрезы анализировали при помощи окрашивания гематоксилином и эозином, пентахромного окрашивания по Расселлу – Мовату, иммунофлюоресцентного окрашивания на маркеры эндотелиальных клеток (ЭК) (CD31 и VE-кадгерин), сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК) (SM-MHC и α-SMA), механочувствительных транскрипционных факторов (KLF2 и KLF4), транскрипционные факторы артериальной дифференцировки (HES1, HEY1, ERG), транскрипционные факторы и маркеры венозной дифференцировки (NR2F2, NRP2), транскрипционные факторы и маркеры лимфатической дифференцировки (PROX1, LYVE1, VEGFR3), а также иммуногистохимического окрашивания на маркеры венозной дифференцировки NR2F2. Готовые микропрепараты анализировали посредством световой и конфокальной микроскопии.

Результаты. В  сравнении  с  маркерами  ЭК  (CD31  и VE-кадгерином)  маркеры  СГМК (SM-MHC и α-SMA) позволяли осуществлять объективную визуализацию и оценку сосудистой геометрии и обеспечивали максимальное соотношение «сигнал – шум» независимо от вида маркера, типа сосуда или антитела. Аутофлюоресценция и специфичный гистологический паттерн эластических мембран в ходе окрашивания по Расселлу – Мовату позволяли дифференцировать артериолы от остальных сосудов микроциркуляторного русла. Несмотря на то что иммуноокрашивание аорт крыс показало специфичные маркеры венозного (KLF2 и PROX1) и капиллярного (HEY1) эндотелия, данные находки не нашли подтверждения при иммуноокрашивании БПВ человека. Таким образом, специфичных маркеров венул и капилляров в тканях взрослого человека не идентифицировано, несмотря на анализ широкой палитры классических маркеров различных эндотелиальных дифферонов.

Заключение. Для иммунодетекции сосудов микроциркуляторного русла целесообразно использовать маркеры СГМК (SM-MHC и α-SMA), а не маркеры ЭК (CD31 и VE-кадгерин). Отсутствие специфичных маркеров дифференцировки микрососудов (в частности vasa vasorum) позволяет предположить пентахромное окрашивание по Расселлу – Мовату в качестве оптимальной опции для машинного обучения нейронных сетей с целью анализа сосудов микроциркуляторного русла.

1. Boyle E.C., Sedding D.G., Haverich A. Targeting vasa vasorum dysfunction to prevent atherosclerosis. Vascul Pharmacol. 2017; 96–98: 5-10. doi: 10.1016/j.vph.2017.08.003.

2. Mulligan-Kehoe M.J., Simons M. Vasa vasorum in normal and diseased arteries. Circulation. 2014; 129(24): 2557–2566. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.007189.

3. Herbst M., Holzenbein T.J., Minnich B. Characterization of the vasa vasorum in the human great saphenous vein: a scanning electron microscopy and 3D-morphometry study using vascular corrosion casts. Microsc Microanal. 2014; 20(4): 1120–1133. doi: 10.1017/S1431927614001287.

4. Mollmark J.I., Park A.J., Kim J., Wang T.Z., Katzenell S., Shipman S.L., Zagorchev L.G., Simons M., Mulligan-Kehoe M.J. Fibroblast growth factor-2 is required for vasa vasorum plexus stability in hypercholesterolemic mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012; 32: 2644–2651. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.252544.

5. Kwon H.M., Sangiorgi G., Ritman E.L., McKenna C., Holmes D.R.Jr., Schwartz R.S., Lerman A. Enhanced coronary vasa vasorum neovascularization in experimental hypercholesterolemia. J Clin Invest. 1998; 101: 1551–1556. doi: 10.1172/JCI1568.

6. Ramani P., Dungwa J.V., May M.T. LYVE1 upregulation and lymphatic invasion correlate with adverse prognostic factors and lymph node metastasis in neuroblastoma. Virchows Arch. 2012; 460(2): 183–191. doi: 10.1007/s00428-011-1190-y.

7. Jackson D.G., Prevo R., Clasper S., Banerji S. LYVE1, the lymphatic system and tumor lymphangiogenesis. Trends Immunol. 2001; 22(6): 317–321. doi: 10.1016/s1471-4906(01)01936-6.

8. Hong Y.K., Harvey N., Noh Y.H., Schacht V., Hirakawa S., Detmar M., Oliver G. Prox1 is a master control gene in the program specifying lymphatic endothelial cell fate. Dev Dyn. 2002; 225: 351–357. doi: 10.1002/dvdy.10163.

9. Pusztaszeri M.P., Seelentag W., Bosman F.T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. 2006; 54(4): 385–395. doi: 10.1369/jhc.4A6514.2005.

10. Фролов А.В., Терехов А.А., Богданов Л.А., Мухамадияров Р.А., Кутихин А.Г. Сравнительное изучение vasa vasorum и неоинтимы в кондуитах для коронарного шунтирования. Ангиология и сосудистая хирургия.2021; 27(2):121-126. doi: 10.33529/ANGIO2021218

11. Kutikhin A.G., Tupikin A.E., Matveeva V.G., Shishkova D.K., Antonova L.V., Kabilov M.R., Velikanova E.A. Human Peripheral Blood-Derived Endothelial Colony-Forming Cells Are Highly Similar to Mature Vascular Endothelial Cells yet Demonstrate a Transitional Transcriptomic Signature. Cells. 2020; 9(4): 876. doi: 10.3390/cells9040876.

12. Sidney L.E., Branch M.J., Dunphy S.E., Dua H.S., Hopkinson A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 2014; 32(6): 1380–9. doi: 10.1002/stem.1661.

13. Thachil J. Dual origins and dual roles for von Willebrand factor. J Thromb Haemost. 2021; 19(1): 308–309. doi: 10.1111/jth.15152.

14. Богданов Л.А., Осяев Н.Ю., Богданова Ю.Д., Мухамадияров Р.А., Шабаев А.Р., Евтушенко А.В., Кутихин А.Г. Анализ топографических сценариев формирования очагов кальцификации в дисфункциональных клапанах сердца и атеросклеротических бляшках. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2021;10(3):26-33. doi: 10.17802/2306-1278-2021-10-3-26-33.

15. Alarcon-Martinez L., Yilmaz-Ozcan S., Yemisci M., Schallek J., Kılıç K., Can A., Di Polo A., Dalkara T. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. Elife. 2018; 7: e34861. doi: 10.7554/eLife.34861.

16. Hutter-Schmid B., Humpel C. Alpha-Smooth Muscle Actin mRNA and Protein Are Increased in Isolated Brain Vessel Extracts of Alzheimer Mice. Pharmacology. 2016; 98(5-6): 251-260. doi: 10.1159/000448007.

17. Zambach S.A., Cai C., Helms H.C.C., Hald B.O., Dong Y., Fordsmann J.C., Nielsen R.M., Hu J., Lønstrup M., Brodin B., Lauritzen M.J. Precapillary sphincters and pericytes at first-order capillaries as key regulators for brain capillary perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021; 118(26): e2023749118. doi: 10.1073/pnas.2023749118.

18. Zhou H.J., Qin L., Jiang Q., Murray K.N., Zhang H., Li B., Lin Q., Graham M., Liu X., Grutzendler J., Min W. Caveolae-mediated Tie2 signaling contributes to CCM pathogenesis in a brain endothelial cell-specific Pdcd10-deficient mouse model. Nat Commun. 2021; 12(1): 504. doi: 10.1038/s41467-020-20774-0.

19. Jerome J.A., Wenzel S.E., Trejo Bittar H.E. Digital Imaging Analysis Reveals Reduced Alveolar α-Smooth Muscle Actin Expression in Severe Asthma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2021; 29(7): 506–512. doi: 10.1097/PAI.0000000000000926.

20. Yuan K., Agarwal S., Chakraborty A., Condon D.F., Patel H., Zhang S., Huang F., Mello S.A., Kirk O.I., Vasquez R., de Jesus Perez V.A. Lung Pericytes in Pulmonary Vascular Physiology and Pathophysiology. Compr Physiol. 2021; 11(3): 2227–2247. doi: 10.1002/cphy.c200027.

21. Sava P., Ramanathan A., Dobronyi A., Peng X., Sun H., Ledesma-Mendoza A., Herzog E.L., Gonzalez A.L. Human pericytes adopt myofibroblast properties in the microenvironment of the IPF lung. JCI Insight. 2017;2(24):e96352. doi: 10.1172/jci.insight.96352.

22. Swift M.R., Pham V.N., Castranova D., Bell K., Poole R.J., Weinstein B.M. SoxF factors and Notch regulate nr2f2 gene expression during venous differentiation in zebrafish. Dev Biol. 2014; 390(2): 116–125. doi: 10.1016/j.ydbio.2014.03.018.

23. Chen X., Qin J., Cheng C.M., Tsai M.J., Tsai S.Y. COUP-TFII is a major regulator of cell cycle and Notch signaling pathways. Mol Endocrinol. 2012; 26(8): 1268–1277. doi: 10.1210/me.2011-1305.

24. Melincovici C.S., Boşca A.B., Şuşman S., Mărginean M., Mihu C., Istrate M., Moldovan I.M., Roman A.L., Mihu C.M. Vascular endothelial growth factor (VEGF) - key factor in normal and pathological angiogenesis. Rom J Morphol Embryol. 2018; 59(2): 455–467.

25. Hong Y.K., Harvey N., Noh Y.H., Schacht V., Hirakawa S., Detmar M., Oliver G. Prox1 is a master control gene in the program specifying lymphatic endothelial cell fate. Dev Dyn. 2002; 225: 351–357. doi: 10.1002/dvdy.10163.

26. Ramani P., Dungwa J.V., May M.T. LYVE1 upregulation and lymphatic invasion correlate with adverse prognostic factors and lymph node metastasis in neuroblastoma. Virchows Arch. 2012; 460(2): 183–191. doi: 10.1007/s00428-011-1190-y.

27. Jackson D.G. The lymphatics revisited: new perspectives from the hyaluronan receptor LYVE-1. Trends Cardiovasc Med. 2003; 13(1): 1–7. doi: 10.1016/s1050-1738(02)00189-5.

28. Heinolainen K., Karaman S., D'Amico G., Tammela T., Sormunen R., Eklund L., Alitalo K., Zarkada G. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circ Res. 2017; 120(9): 1414–1425. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.310477.

29. Alghamdi A.A.A., Benwell C.J., Atkinson S.J., Lambert J., Johnson R.T., Robinson S.D. NRP2 as an Emerging Angiogenic Player; Promoting Endothelial Cell Adhesion and Migration by Regulating Recycling of α5 Integrin. Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 395. doi: 10.3389/fcell.2020.00395.