ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКЦИИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ КЛЕТКАМИ ЛИНИИ THP-1 ПРИ СТИМУЛЯЦИИ IN VITRO

Основные положения

• Внеклеточные везикулы (ВВ) – мембранные объекты c молекулярным грузом внутри себя и на поверхности, выполняющие разнообразные биологические функции, связанные с межклеточным взаимодействием, поэтому являются перспективным объектом для диагностических и терапевтических целей.
• Культура клеток острого миелоидного лейкоза человека (THP-1) – классическая модельная моноцитарно-макрофагальная система. Спектр секретируемых этой культурой ВВ гетерогенен и недостаточно охарактеризован к настоящему времени.
• В работе проведено сравнение продуцируемых клетками THP-1 ВВ при воздействии различных стимуляторов.

Цель. Количественная и качественная характеристика внеклеточных везикул (ВВ), продуцируемых клетками линии THP-1, в зависимости от использованного стимулятора и его дозы.

Материалы и методы. В исследовании использованы клетки культуры THP-1. Для стимуляции клеток применены 4-форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) в дозах 5, 16 и 50 нг/мл, липополисахарид (ЛПС) в дозах 0,1, 0,3 и 1,0 нг/мл и фактор некроза опухоли (ФНО) в дозах 5, 10 и 20 нг/мл. Активация клеток оценена изменением уровня экспрессии CD54, а наличие апоптоза/некроза – посредством подсчета DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол)-позитивных клеток с помощью высокочувствительной проточной цитометрии (hs-FCM). Размерность продуцируемых везикул и их количественная характеристика приведены с использованием анализа траектории наночастиц (NTA). Качественная характеристика экспрессируемых поверхностных молекулярных маркеров (CD9, CD63, CD54) представлена с помощью высокочувствительной многоцветной проточной цитометрии (hs-FCM).           

Результаты. Стимуляция ФНО и PMA в средних и высоких дозировках приводит к нарастанию секретируемой фракции малых (30–150 нм) ВВ, экспрессирующих тетраспаниновые маркеры (CD9, CD63). Малые дозы ФНО и PMA не приводили к достоверному приросту количества ВВ. При использовании всех дозировок ЛПС отмечено некоторое количественное снижение ВВ в диапазоне 30–150 нм (малые ВВ). Однако средние и высокие дозы ЛПС вызывали достоверную селективную секрецию CD63-положительных ВВ при полном отсутствии динамики изменения CD9-позитивных везикул. Активация клеток, оцениваемая по экспрессии CD54, носила дозозависимый характер и была наиболее выражена при стимуляции PMA.

Заключение. Каждый вид использованной стимуляции клеток THP-1 провоцирует изменение функциональной активности клеток в отношении продуцируемых ими ВВ. При этом может меняться не только количественный, но и качественный состав продуцируемых объектов. Наиболее предпочтительными в стимуляции везикуляции оказались средние и высокие дозы ФНО и PMA. Стимуляция ЛПС в средних и высоких дозах может быть использована для получения изолированной CD63-положительной фракции ВВ.

1. Zaborowski M.P., Balaj L., Breakefield X.O., Lai C.P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 2015;65(8):783–97. doi:10.1093/biosci/biv084

2. Yáñez-Mó M., Siljander P.R.M., Andreu Z., Bedina Zavec A., Borràs F.E., Buzas E.I., Casal E., Cappello F. et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015;4(1):27066. doi:10.3402/jev.v4.27066

3. Borges F.T., Reis L.A., Schor N. Extracellular vesicles: structure, function, and potential clinical uses in renal diseases. Brazilian J Med Biol Res. 2013;46(10):824–30. doi:10.1590/1414-431X20132964

4. Mathivanan S., Ji H., Simpson R.J. Exosomes: Extracellular organelles important in intercellular communication. J Proteomics. 2010;73(10):1907–20. doi:10.1016/j.jprot.2010.06.006

5. Ludwig A.K., Giebel B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. Int J Biochem Cell Biol. 2012;44(1):11–5. doi:10.1016/j.biocel.2011.10.005

6. Théry C., Witwer K.W., Aikawa E., Alcaraz M.J., Anderson J.D., Andriantsitohaina R., Antoniou A., Arab T. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1535750. doi:10.1080/20013078.2018.1535750

7. Reales-Calderón J.A., Vaz C., Monteoliva L., Molero G., Gil C. Candida albicans Modifies the Protein Composition and Size Distribution of THP-1 Macrophage-Derived Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 2017;16(1):87–105. doi:10.1021/acs.jproteome.6b00605

8. Gangadaran P., Rajendran R.L., Oh J.M., Hong C.M., Jeong S.Y., Lee S.W., Lee J., Ahn B.C. Extracellular vesicles derived from macrophage promote angiogenesis In vitro and accelerate new vasculature formation In vivo. Exp Cell Res. 2020;394(2):112146. doi:10.1016/j.yexcr.2020.112146

9. Liu S., Chen J., Shi J., Zhou W., Wang L., Fang W., Zhong Y., Chen X., Chen Y., Sabri A., Liu S. M1-like macrophage-derived exosomes suppress angiogenesis and exacerbate cardiac dysfunction in a myocardial infarction microenvironment. Basic Res Cardiol. 2020;115(2):22. doi:10.1007/s00395-020-0781-7

10. Chen B., Luo L., Wei X., Gong D., Li Z., Li S., Tang W., Jin L. M1 Bone Marrow-Derived Macrophage-Derived Extracellular Vesicles Inhibit Angiogenesis and Myocardial Regeneration Following Myocardial Infarction via the MALAT1/MicroRNA-25-3p/CDC42 Axis. Oxid Med Cell Longev. 2021;2021:1–26. doi:10.1155/2021/9959746

11. Aharon A, Tamari T, Brenner B. Monocyte-derived microparticles and exosomes induce procoagulant and apoptotic effects on endothelial cells. Thromb Haemost. 2008;100(05):878–85. doi:10.1160/TH07-11-0691

12. Pieters B.C.H., Cappariello A., van den Bosch M.H.J., van Lent P.L.E.M., Teti A., van de Loo F.A.J. Macrophage-Derived Extracellular Vesicles as Carriers of Alarmins and Their Potential Involvement in Bone Homeostasis. Front Immunol. 2019;10:1901. doi:10.3389/fimmu.2019.01901

13. Kang M., Huang C.C., Lu Y., Shirazi S., Gajendrareddy P., Ravindran S., Cooper L.F. Bone regeneration is mediated by macrophage extracellular vesicles. Bone. 2020;141:115627. doi:10.1016/j.bone.2020.115627

14. Ding J., Zhang Y., Cai X., Zhang Y., Yan S., Wang J., Zhang S., Yin T., Yang C., Yang J. Extracellular vesicles derived from M1 macrophages deliver miR-146a-5p and miR-146b-5p to suppress trophoblast migration and invasion by targeting TRAF6 in recurrent spontaneous abortion. Theranostics. 2021;11(12):5813–30. doi:10.7150/thno.58731

15. Singhto N., Kanlaya R., Nilnumkhum A., Thongboonkerd V. Roles of Macrophage Exosomes in Immune Response to Calcium Oxalate Monohydrate Crystals. Front Immunol. 2018;9. doi:10.3389/fimmu.2018.00316

16. Gao W., Guo X., Wang Y., Jian D., Li M. Monocyte-derived extracellular vesicles upon treated by palmitate promote endothelial migration and monocytes attachment to endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2020;523(3):685–91. doi:10.1016/j.bbrc.2019.12.095

17. Lee H.D., Kim Y.H., Kim D.S. Exosomes derived from human macrophages suppress endothelial cell migration by controlling integrin trafficking. Eur J Immunol. 2014;44(4):1156–69. doi:10.1002/eji.201343660

18. Volgers C., Benedikter B.J., Grauls G.E., Savelkoul P.H.M., Stassen F.R.M. Immunomodulatory role for membrane vesicles released by THP-1 macrophages and respiratory pathogens during macrophage infection. BMC Microbiol. 2017;17(1):216. doi:10.1186/s12866-017-1122-3

19. Wang Y.X., Lin C., Cui L.J., Deng T.Z., Li Q.M., Chen F.Y., Miao X.P. Mechanism of M2 macrophage-derived extracellular vesicles carrying lncRNA MEG3 in inflammatory responses in ulcerative colitis. Bioengineered. 2021;12(2):12722–39. doi:10.1080/21655979.2021.2010368

20. Osada-Oka M., Shiota M., Izumi Y., Nishiyama M., Tanaka M., Yamaguchi T., Sakurai E., Miura K., Iwao H. Macrophage-derived exosomes induce inflammatory factors in endothelial cells under hypertensive conditions. Ortega A, editor. Hypertens Res. 2017;40(4):353–60. doi:10.1038/hr.2016.163

21. Wang G., Jin S., Ling X., Li Y., Hu Y., Zhang Y., Huang Y., Chen T., Lin J., Ning Z., Meng Y., Li X. Proteomic Profiling of LPS‐Induced Macrophage‐Derived Exosomes Indicates Their Involvement in Acute Liver Injury. Proteomics. 2019;19(3):1800274. doi:10.1002/pmic.201800274

22. Shao J., Li S., Liu Y., Zheng M. Extracellular vesicles participate in macrophage-involved immune responses under liver diseases. Life Sci. 2020;240:117094. doi:10.1016/j.lfs.2019.117094

23. Kawata R., Oda S., Koya Y., Kajiyama H., Yokoi T. Macrophage-derived extracellular vesicles regulate concanavalin A-induced hepatitis by suppressing macrophage cytokine production. Toxicology. 2020;443:152544. doi:10.1016/j.tox.2020.152544

24. Shi C., Ulke-Lemée A., Deng J., Batulan Z., O’Brien E.R. Characterization of heat shock protein 27 in extracellular vesicles: a potential anti‐inflammatory therapy. FASEB J. 2019;33(2):1617–30. doi:10.1096/fj.201800987R

25. Chanput W., Mes J.J., Wichers H.J. THP-1 cell line: An in vitro cell model for immune modulation approach. Int Immunopharmacol. 2014;23(1):37–45. doi:10.1016/j.intimp.2014.08.002

26. Bosshart H., Heinzelmann M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Ann Transl Med. 2016;4(21):438–438. doi:10.21037/atm.2016.08.53

27. Tedesco S., De Majo F., Kim J., Trenti A., Trevisi L., Fadini G.P., Bolego C., Zandstra P.W., Cignarella A., Vitiello L. Convenience versus Biological Significance: Are PMA-Differentiated THP-1 Cells a Reliable Substitute for Blood-Derived Macrophages When Studying in Vitro Polarization? Front Pharmacol. 2018;9. doi:10.3389/fphar.2018.00071

28. Wang J.G., Williams J.C., Davis B.K., Jacobson K., Doerschuk C.M., Ting J.P., Mackman N. Monocytic microparticles activate endothelial cells in an IL-1β–dependent manner. Blood. 2011;118(8):2366–74. doi:10.1182/blood-2011-01-330878

29. Li X., Lei Y., Wu M., Li N. Regulation of Macrophage Activation and Polarization by HCC-Derived Exosomal lncRNA TUC339. Int J Mol Sci. 2018;19(10):2958. doi:10.3390/ijms19102958

30. Chen L., Yao X., Yao H., Ji Q., Ding G., Liu X. Exosomal miR‐103‐3p from LPS‐activated THP‐1 macrophage contributes to the activation of hepatic stellate cells. FASEB J. 2020;34(4):5178–92. doi:10.1096/fj.201902307RRR

31. Liu H., Zhang L., Li M., Zhao F., Lu F., Zhang F., Chen S., Guo J., Zhang R., Yin H. Bone mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles inhibit DAPK1-mediated inflammation by delivering miR-191 to macrophages. Biochem Biophys Res Commun. 2022;598:32–9. doi:10.1016/j.bbrc.2022.02.009

32. McDonald M.K., Tian Y., Qureshi R.A., Gormley M., Ertel A., Gao R., Aradillas Lopez E., Alexander G.M., Sacan A., Fortina P., Ajit S.K. Functional significance of macrophage-derived exosomes in inflammation and pain. Pain. 2014;155(8):1527–39. doi:10.1016/j.pain.2014.04.029

33. Maeß M.B., Wittig B., Cignarella A., Lorkowski S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. J Immunol Methods. 2014;402(1–2):76–81. doi:10.1016/j.jim.2013.11.006

34. Park E.K., Jung H.S., Yang H.I., Yoo M.C., Kim C., Kim K.S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 2007;56(1):45–50. doi:10.1007/s00011-007-6115-5

35. Daigneault M., Preston J.A., Marriott H.M., Whyte M.K.B., Dockrell D.H. The Identification of Markers of Macrophage Differentiation in PMA-Stimulated THP-1 Cells and Monocyte-Derived Macrophages. PLoS One. 2010;5(1):e8668. doi:10.1371/journal.pone.0008668

36. Kim Y.K., Hwang J.H., Lee H.T. Differential susceptibility to lipopolysaccharide affects the activation of toll-like-receptor 4 signaling in THP-1 cells and PMA-differentiated THP-1 cells. Innate Immun. 2022;28(3–4):122–9. doi:10.1177/17534259221100170

37. Sindhu S., Akhter N., Wilson A., Thomas R., Arefanian H., Al Madhoun A., Al-Mulla F., Ahmad R. MIP-1α Expression Induced by Co-Stimulation of Human Monocytic Cells with Palmitate and TNF-α Involves the TLR4-IRF3 Pathway and Is Amplified by Oxidative Stress. Cells. 2020;9(8):1799. doi:10.3390/cells9081799

38. Akhter N., Wilson A., Thomas R., Al-Rashed F., Kochumon S., Al-Roub A., Arefanian H., Al-Madhoun A., Al-Mulla F., Ahmad R., Sindhu S. ROS/TNF-α Crosstalk Triggers the Expression of IL-8 and MCP-1 in Human Monocytic THP-1 Cells via the NF-κB and ERK1/2 Mediated Signaling. Int J Mol Sci. 2021;22(19):10519. doi:10.3390/ijms221910519

39. Dubashynskaya N.V., Golovkin A.S., Kudryavtsev I.V., Prikhodko S.S., Trulioff A.S., Bokatyi A.N., Poshina D.N., Raik S.V., Skorik Y.A. Mucoadhesive cholesterol-chitosan self-assembled particles for topical ocular delivery of dexamethasone. Int J Biol Macromol. 2020;158:811–8. doi:10.1016/j.ijbiomac.2020.04.251

40. Nurkhametova D., Kudryavtsev I., Guselnikova V., Serebryakova M., Giniatullina R.R., Wojciechowski S., Tore F., Rizvanov A., Koistinaho J., Malm T., Giniatullin R. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Front Cell Neurosci. 2019;13. doi:10.3389/fncel.2019.00045

41. Kondratov K., Nikitin Y., Fedorov A., Kostareva A., Mikhailovskii V., Isakov D., Ivanov A., Golovkin A. Heterogeneity of the nucleic acid repertoire of plasma extracellular vesicles demonstrated using high‐sensitivity fluorescence‐activated sorting. J Extracell Vesicles. 2020;9(1):1743139. doi:10.1080/20013078.2020.1743139

42. Fedorov A., Kondratov K., Kishenko V., Mikhailovskii V., Kudryavtsev I., Belyakova M., Sidorkevich S., Vavilova T., Kostareva A., Sirotkina O., Golovkin A. Application of high-sensitivity flow cytometry in combination with low-voltage scanning electron microscopy for characterization of nanosized objects during platelet concentrate storage. Platelets. 2020;31(2):226–35. doi:10.1080/09537104.2019.1599337

43. Nolan J.P. Flow Cytometry of Extracellular Vesicles: Potential, Pitfalls, and Prospects. Curr Protoc Cytom. 2015;73(1). doi:10.1002/0471142956.cy1314s73

44. Welsh J.A., Van Der Pol E., Arkesteijn G.J.A., Bremer M., Brisson A., Coumans F., Dignat-George F., Duggan E. et al. MIFlowCyt‐EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. J Extracell Vesicles. 2020;9(1):1713526. doi:10.1080/20013078.2020.1713526

45. Kudryavtsev I., Kalinina O., Bezrukikh V., Melnik O., Golovkin A. The Significance of Phenotyping and Quantification of Plasma Extracellular Vesicles Levels Using High-Sensitivity Flow Cytometry during COVID-19 Treatment. Viruses. 2021;13(5):767. doi:10.3390/v13050767

46. Kowal J., Tkach M., Théry C. Biogenesis and secretion of exosomes. Curr Opin Cell Biol. 2014;29:116–25. doi:10.1016/j.ceb.2014.05.004

47. Crenshaw B.J., Gu L., Sims B., Matthews Q.L. Exosome Biogenesis and Biological Function in Response to Viral Infections. Open Virol J. 2018;12(1):134–48. doi:10.2174/1874357901812010134

48. Sheikh N.A., Jones L.A. CD54 is a surrogate marker of antigen presenting cell activation. Cancer Immunol Immunother. 2008;57(9):1381–90. doi:10.1007/s00262-008-0474-9

49. Mitachi T., Kouzui M., Maruyama R., Yamashita K., Ogata S., Kojima H., Itagaki H. Some non-sensitizers upregulate CD54 expression by activation of the NLRP3 inflammasome in THP-1 cells. J Toxicol Sci. 2019;44(3):213–24. doi:10.2131/jts.44.213

50. Andreu Z., Yáñez-Mó. M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front Immunol. 2014;5:442. doi: 10.3389/fimmu.2014.00442.

51. MacDonald C., Payne J.A., Aboian M., Smith W., Katzmann D.J., Piper R.C. A Family of Tetraspans Organizes Cargo for Sorting into Multivesicular Bodies. Dev Cell. 2015;33(3):328–42. doi:10.1016/j.devcel.2015.03.007

52. MacDonald C., Stamnes M.A., Katzmann D.J., Piper R.C. Tetraspan cargo adaptors usher GPI-anchored proteins into multivesicular bodies. Cell Cycle. 2015;14(23):3673–8. doi:10.1080/15384101.2015.1100773

53. Larios J., Mercier V., Roux A., Gruenberg J. ALIX- and ESCRT-III–dependent sorting of tetraspanins to exosomes. J Cell Biol. 2020;219(3). doi:10.1083/jcb.201904113

54. Ziegler-Heitbrock H.W.L., Ulevitch R.J. CD14: Cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 1993;14(3):121–5. doi:10.1016/0167-5699(93)90212-4

55. Raposo G., Stoorvogel W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 2013;200(4):373–83. doi:10.1083/jcb.201211138

56. van Niel G., D’Angelo G., Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018;19(4):213–28. doi:10.1038/nrm.2017.125

57. Reutelingsperger C.P.M., van Heerde W.L. Annexin V, the regulator of phosphatidylserine-catalyzed inflammation and coagulation during apoptosis. Cell Mol Life Sci. 1997;53(6):527–32. doi:10.1007/s000180050067