ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРОВАННОГО КАЛЬЦИЯ, КАЛЬЦИПРОТЕИНОВЫХ МОНОМЕРОВ И КАЛЬЦИПРОТЕИНОВЫХ ЧАСТИЦ НА ПЕРВИЧНЫЕ АРТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

Основные положения

• Для повышения молярной концентрации ионизированного кальция в бессывороточной среде для культивирования эндотелиальных клеток и сыворотке крови крыс Wistar на 10% (в 1,1 раза) с целью моделирования «высокого нормального» уровня ионизированного кальция необходимо добавлять 10 мкг кальция (к примеру, используя хлорид кальция в виде донора Ca²⁺) на 1 мл среды или сыворотки.
• Добавление ионизированного кальция и кальципротеиновых мономеров в концентрации 10 мкг/мл не вызывает патологических эффектов в культурах первичных артериальных эндотелиальных клеток, при этом кальципротеиновые мономеры интернализируются эндотелиальными клетками по аналогии с кальципротеиновыми частицами.
• Добавление кальципротеиновых частиц к первичным эндотелиальным клеткам коронарной артерии человека в концентрации 10 мкг/мл вызывает их провоспалительную активацию, которая проявляется повышением экспрессии генов молекул адгезии лейкоцитов VCAM1, ICAM1 и SELE и генов провоспалительных цитокинов IL6, CXCL8 и CXCL1.

Цель. Сравнительный анализ патологических эффектов различных форм кальция, добавленных к эндотелиальным клеткам в равной концентрации в виде ионов кальция, кальципротеиновых мономеров (КПМ) и кальципротеиновых частиц (КПЧ).

Материалы и методы. Искусственный синтез КПМ и КПЧ проводили путем перенасыщения солевого раствора NaCl, содержащего физиологическую концентрацию альбумина, ионами кальция (используя в качестве донора катиона кальция CaCl₂) и фосфора (используя в качестве донора фосфат-анионов Na₂HPO₄). Разделение КПМ и КПЧ производили последовательно путем ультрацентрифугирования (для выделения КПЧ) и ультрафильтрации (для разделения КПМ и свободных минеральных ионов). Измерение концентрации кальция в КПМ и КПЧ проводили колориметрическим методом на основе реакции ортокрезолфталеинкомплексона с ионами кальция в щелочной среде. Анализ интернализации флюоресцентно меченных КПМ и КПЧ эндотелиальными клетками проводили после их совместной одночасовой инкубации в системе пульсирующего потока при помощи конфокальной микроскопии. Ионизированный кальций (в виде CaCl₂), КПМ и КПЧ добавляли к конфлюэнтным первичным культурам эндотелиальных клеток коронарной и внутренней грудной артерий (n = 6 лунок на группу) в концентрации 10 мкг/мл (моделируя повышение молярной концентрации ионизированного кальция на 10%). Через 24 ч проводили анализ генной экспрессии методом количественной полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции.

Результаты. В течение часа циркуляции в пульсирующем потоке КПМ и КПЧ интернализировались эндотелиальными клетками. Добавление ионизированного кальция и кальципротеиновых мономеров в концентрации 10 мкг/мл не вызывало патологических эффектов в культурах артериальных эндотелиальных клеток, в то время как добавление кальципротеиновых частиц в указанной концентрации вызывало повышение экспрессии генов молекул адгезии лейкоцитов VCAM1, ICAM1 и SELE и генов провоспалительных цитокинов IL6, CXCL8 и CXCL1 в первичных эндотелиальных клетках коронарной артерии.

Заключение. Поскольку дисфункцию эндотелия в физиологической концентрации вызывали исключительно КПЧ, а не КПМ или свободные ионы кальция, можно сделать вывод о том, что патологические эффекты кальция в значительной степени определяются формой его добавления, а не только добавляемой концентрацией.

1. Kutikhin A.G., Feenstra L., Kostyunin A.E., Yuzhalin A.E., Hillebrands J.L., Krenning G. Calciprotein Particles: Balancing Mineral Homeostasis and Vascular Pathology. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(5):1607-1624. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.315697.

2. Heiss A., Eckert T., Aretz A., Richtering W., van Dorp W., Schäfer C., Jahnen-Dechent W. Hierarchical role of fetuin-A and acidic serum proteins in the formation and stabilization of calcium phosphate particles. J Biol Chem. 2008;283(21):14815-25. doi: 10.1074/jbc.M709938200.

3. Heiss A., DuChesne A., Denecke B., Grötzinger J., Yamamoto K., Renné T., Jahnen-Dechent W. Structural basis of calcification inhibition by alpha 2-HS glycoprotein/fetuin-A. Formation of colloidal calciprotein particles. J Biol Chem. 2003;278(15):13333-41. doi: 10.1074/jbc.M210868200.

4. Shishkova D.K., Velikanova E.A., Bogdanov L.A., Sinitsky M.Y., Kostyunin A.E., Tsepokina A.V., Gruzdeva O.V., Mironov A.V., Mukhamadiyarov R.A., Glushkova T.V., Krivkina E.O., Matveeva V.G., Hryachkova O.N., Markova V.E., Dyleva Y.A., Belik E.V., Frolov A.V., Shabaev A.R., Efimova O.S., Popova A.N., Malysheva V.Y., Kolmykov R.P., Sevostyanov O.G., Russakov D.M., Dolganyuk V.F., Gutakovsky A.K., Zhivodkov Y.A., Kozhukhov A.S., Brusina E.B., Ismagilov Z.R., Barbarash O.L., Yuzhalin A.E., Kutikhin A.G. Calciprotein Particles Link Disturbed Mineral Homeostasis with Cardiovascular Disease by Causing Endothelial Dysfunction and Vascular Inflammation. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12458. doi: 10.3390/ijms222212458.

5. Shishkova D., Markova V., Sinitsky M., Tsepokina A., Velikanova E., Bogdanov L., Glushkova T., Kutikhin A. Calciprotein Particles Cause Endothelial Dysfunction under Flow. Int J Mol Sci. 2020;21(22):8802. doi: 10.3390/ijms21228802.

6. Kutikhin A.G., Velikanova E.A., Mukhamadiyarov R.A., Glushkova T.V., Borisov V.V., Matveeva V.G., Antonova L.V., Filip'ev D.E., Golovkin A.S., Shishkova D.K., Burago A.Y., Frolov A.V., Dolgov V.Y., Efimova O.S., Popova A.N., Malysheva V.Y., Vladimirov A.A., Sozinov S.A., Ismagilov Z.R., Russakov D.M., Lomzov A.A., Pyshnyi D.V., Gutakovsky A.K., Zhivodkov Y.A., Demidov E.A., Peltek S.E., Dolganyuk V.F., Babich O.O., Grigoriev E.V., Brusina E.B., Barbarash O.L., Yuzhalin A.E. Apoptosis-mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci Rep. 2016;6:27255. doi: 10.1038/srep27255.

7. Feenstra L., Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Buikema H., Zeper L.W., Bourgonje A.R., Krenning G., Hillebrands J.L. Calciprotein Particles Induce Endothelial Dysfunction by Impairing Endothelial Nitric Oxide Metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(3):443-455. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318420.

8. Shishkova D., Lobov A., Zainullina B., Matveeva V., Markova V., Sinitskaya A., Velikanova E., Sinitsky M., Kanonykina A., Dyleva Y., Kutikhin A. Calciprotein Particles Cause Physiologically Significant Pro-Inflammatory Response in Endothelial Cells and Systemic Circulation. Int J Mol Sci. 2022;23(23):14941. doi: 10.3390/ijms232314941.

9. Kutikhin A.G. Pathophysiological and clinical significance of mineral homeostasis disorders in the development of cardiovascular disease. Fundamental and Clinical Medicine. 2021;6(2):82-102. doi: 10.23946/2500-0764-2021-6-1-82-102. (In Russian)

10. Lutsey P.L., Alonso A., Michos E.D., Loehr L.R., Astor B.C., Coresh J., Folsom A.R. Serum magnesium, phosphorus, and calcium are associated with risk of incident heart failure: the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study. Am J Clin Nutr. 2014;100(3):756-64. doi: 10.3945/ajcn.114.085167.

11. Rohrmann S., Garmo H., Malmstrom H., Hammar N., Jungner I., Walldius G., Van Hemelrijck M. Association between serum calcium concentration and risk of incident and fatal cardiovascular disease in the prospective AMORIS study. Atherosclerosis. 2016;251:85-93. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2016.06.004.

12. Reid I.R., Gamble G.D., Bolland M.J. Circulating calcium concentrations, vascular disease and mortality: a systematic review. J Intern Med. 2016;279(6):524-40. doi: 10.1111/joim.12464.

13. Kobylecki C.J., Nordestgaard B.G., Afzal S. Plasma Ionized Calcium and Risk of Cardiovascular Disease: 106 774 Individuals from the Copenhagen General Population Study. Clin Chem. 2021;67(1):265-275. doi: 10.1093/clinchem/hvaa245.

14. Shishkova D.K., Matveeva V.G., Markova V.E., Khryachkova O.N., Indukaeva E.V., Shabaev А.R., Frolov A.V., Kutikhin A.G. Quantification of the initial levels of calciprotein particles as a screening marker of mineral homeostasis in patients with cardiovascular disease and in patients with chronic kidney disease. Russian Journal of Cardiology. 2022;27(12):5064. doi: 10.15829/1560-4071-2022-5064. (In Russioan)

15. Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Khryachkova O.N., Frolov A.V., Osyaev N.Yu., Indukaeva E.V., Gruzdeva O.V., Shabaev A.R., Zagorodnikov N.I., Markova V.E., Bogdanov L.А. Formation of calcium phosphate bions in patients with carotid and coronary atherosclerosis. Russian Journal of Cardiology. 2020;25(12):3881. (In Russian)

16. Xie W.M., Ran L.S., Jiang J., Chen Y.S., Ji H.Y., Quan X.Q. Association between fetuin-A and prognosis of CAD: A systematic review and meta-analysis. Eur J Clin Invest. 2019;49(5):e13091. doi: 10.1111/eci.13091.

17. Ronit A., Kirkegaard-Klitbo D.M., Dohlmann T.L., Lundgren J., Sabin C.A., Phillips A.N., Nordestgaard B.G., Afzal S. Plasma Albumin and Incident Cardiovascular Disease: Results From the CGPS and an Updated Meta-Analysis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2020;40(2):473-482. doi: 10.1161/ATVBAHA.119.313681.

18. Seidu S., Kunutsor S.K., Khunti K. Serum albumin, cardiometabolic and other adverse outcomes: systematic review and meta-analyses of 48 published observational cohort studies involving 1,492,237 participants. Scand Cardiovasc J. 2020;54(5):280-293. doi: 10.1080/14017431.2020.1762918.

19. Heiss A., Pipich V., Jahnen-Dechent W., Schwahn D. Fetuin-A is a mineral carrier protein: small angle neutron scattering provides new insight on Fetuin-A controlled calcification inhibition. Biophys J. 2010;99(12):3986-95. doi: 10.1016/j.bpj.2010.10.030.

20. Koeppert S., Ghallab A., Peglow S., Winkler C.F., Graeber S., Büscher A., Hengstler J.G., Jahnen-Dechent W. Live Imaging of Calciprotein Particle Clearance and Receptor Mediated Uptake: Role of Calciprotein Monomers. Front Cell Dev Biol. 2021;9:633925. doi: 10.3389/fcell.2021.633925.

21. Herrmann M., Schäfer C., Heiss A., Gräber S., Kinkeldey A., Büscher A., Schmitt M.M., Bornemann J., Nimmerjahn F., Herrmann M., Helming L., Gordon S., Jahnen-Dechent W. Clearance of fetuin-A--containing calciprotein particles is mediated by scavenger receptor-A. Circ Res. 2012;111(5):575-84. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.111.261479.

22. Köppert S., Büscher A., Babler A., Ghallab A., Buhl E.M., Latz E., Hengstler J.G., Smith E.R., Jahnen-Dechent W. Cellular Clearance and Biological Activity of Calciprotein Particles Depend on Their Maturation State and Crystallinity. Front Immunol. 2018;9:1991. doi: 10.3389/fimmu.2018.01991.

23. Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Velikanova E.A., Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Markova V.E. Endothelial Dysfunction in the Context of Blood-Brain Barrier Modeling. J Evol Biochem Physiol. 2022;58(3):781-806. doi: 10.1134/S0022093022030139.

24. Shishkova D.K., Sinitskaya A.V., Sinitsky M.Yu., Matveeva V.G., Velikanova E.A., Markova V.E., Kutikhin A.G. Spontaneous endothelial-to-mesenchymal transition in human primary umbilical vein endothelial cells. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2022;11(3):97-114. doi:10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114 (In Russian)]

25. Liberale L., Montecucco F., Tardif J.C, Libby P., Camici G.G. Inflamm-ageing: the role of inflammation in age-dependent cardiovascular disease. Eur Heart J. 2020;41(31):2974-2982. doi: 10.1093/eurheartj/ehz961.