ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ

Основные положения

• Не существует универсального метода оценки цитотоксичности материала. Действительный результат можно достичь, используя нескольких принципиально разных методов исследования, с учётом особенностей тестируемого материала.

Резюме

Актуальность. Несмотря на распространенность и частоту применения, вопросы стандартизации методов определения цитотоксичности материалов для медицинских изделий остаются нерешенными. Широкая вариативность подходов к оценке цитотоксичности in vitro требует от исследователя тщательного планирования испытания с учетом особенностей исследуемого объекта.

Цель. Провести сравнительный анализ чувствительности разных культур клеток и методов оценки цитотоксичности при анализе материала для создания протезов для сердечно-сосудистой системы на примере консервированного ксеноперикарда.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на трех культурах клеток: фибробласты, HUVEC, Ea.hy926, с использованием специфичной для каждой культуры питательной среды. В качестве объекта с цитотоксическим действием использовали образцы ксеноперикарда, хранящиеся в растворе парабенов. Анализировали реакцию клеток в прямом и непрямом контакте с образцами ксеноперикарда, а также в присутствии его экстракта. Проводили МТТ-тест, исследование динамики роста клеток с помощью клеточного анализатора xCelligence, оценку пролиферативной активности клеток с помощью коммерческого набора Click-IT.

Результаты. По результатам проведенного МТТ-теста во всех случаях присутствие в культуральной среде экстракта ксеноперикарда приводило к выраженному снижению жизнеспособности клеток и плотности популяции. Согласно оценке динамики роста, в группах с образцами перикарда отмечали полную гибель клеток. Добавление экстракта консервированного ксеноперикарда не оказало заметного влияния на изменение клеточного индекса роста культуры фибробластов, однако в присутствии образцов ксеноперикарда происходило его выраженное снижение. В культуре HUVEC добавление как экстракта, так и образцов ксеноперикарда в короткие сроки вызывало гибель значительной части клеток. В культуре Ea.hy926 отмечалось снижение темпов пролиферации, однако в течение всего эксперимента продолжалась положительная динамика роста культуры клеток. В присутствии экстракта отмечали отсутствие пролиферирующих клеток в культуре фибробластов, уменьшение их количества в культуре Ea.hy926.

Заключение. Условия проведения эксперимента, тестовая культура и методы оценки должны подбираться индивидуально исходя из особенностей тестируемого материала. Для получения достоверных результатов необходимо использование нескольких принципиально разных методов исследования для более полной характеристики действия цитотоксических агентов на культуру клеток.

1. ГОСТ ISO 10993-5-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro. - Введ. 2013.01.01 – М.: Стандарт информ, 2014. – 10 с. – (Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу).

2. Gruber S., Nickel A. Toxic or not toxic? The specifications of the standard ISO 10993-5 are not explicit enough to yield comparable results in the cytotoxicity assessment of an identical medical device. Front. Med. Technol. 2023;5:1195529. https://doi.org/10.3389/fmedt.2023.1195529.

3. Bellucci D., Salvatori R., Anesi A., Chiarini L., Cannillo V. SBF assays, direct and indirect cell culture tests to evaluate the biological performance of bioglasses and bioglass-based composites: Three paradigmatic cases. Materials Science and Engineering: C. 2019;96:757-764. https://doi.org/10.1016/j.msec.2018.12.006.

4. Braun K., Stürzel C.M., Biskupek J., Kaiser U., Kirchhoff F., Lindén M. Comparison of different cytotoxicity assays for in vitro evaluation of mesoporous silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 2018;52:214-221. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2018.06.019.

5. Diemer F., Stark H., Helfgen E.H., Enkling N., Probstmeier R., Winter J., Kraus D. In vitro cytotoxicity of different dental resin-cements on human cell lines. J Mater Sci Mater Med. 2021;32(1):4. https://doi.org/10.1007/s10856-020-06471-w.

6. Wang Y., Ma B., Yin A., Zhang B., Luo R., Pan J., Wang Y. Polycaprolactone vascular graft with epigallocatechin gallate embedded sandwiched layer-by-layer functionalization for enhanced antithrombogenicity and anti-inflammation. J Control Release. 2020;320:226-238. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2020.01.043.

7. Zhou J., Wang M., Wei T., Bai L., Zhao J., Wang K., Feng Y. Endothelial cell-mediated gene delivery for in situ accelerated endothelialization of a vascular graft. ACS Appl Mater Interfaces. 2021;13(14):16097-16105. https://doi.org/10.1021/acsami.1c01869.

8. Kabirian F., Brouki Milan P., Zamanian A., Heying R., Mozafari M.. Nitric oxide-releasing vascular grafts: A therapeutic strategy to promote angiogenic activity and endothelium regeneration. Acta Biomater. 2019;92:82-91. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.05.002.

9. Lee S.J., Kim M.E., Nah H., Seok J.M., Jeong M.H., Park K., Kwon I.K., Lee J.S., Park S.A. Vascular endothelial growth factor immobilized on mussel-inspired three-dimensional bilayered scaffold for artificial vascular graft application: In vitro and in vivo evaluations. J Colloid Interface Sci. 2019;537:333-344. https://doi.org/10.1016/j.jcis.2018.11.039.

10. Daum R., Visser D., Wild C., Kutuzova L., Schneider M., Lorenz G., et al. Fibronectin adsorption on electrospun synthetic vascular grafts attracts endothelial progenitor cells and promotes endothelialization in dynamic in vitro culture. Cells. 2020;9(3):778. https://doi.org/10.3390/cells9030778.

11. Guan G., Yu C., Xing M., Wu Y., Hu X., Wang H., Wang L. Hydrogel small-diameter vascular graft reinforced with a braided fiber strut with improved mechanical properties. Polymers. 2019;11:810. https://doi.org/10.3390/polym11050810.

12. Jirofti N., Mohebbi-Kalhori D., Samimi A., Hadjizadeh A., Kazemzadeh G.H. Small-diameter vascular graft using co-electrospun composite PCL/PU nanofibers. Biomed Mater. 2018;13(5):055014. https://doi.org/10.1088/1748-605X/aad4b5.

13. Fiqrianti I.A., Widiyanti P., Manaf M.A., Savira C.Y., Cahyani N.R., Bella F.R. Poly-L-lactic Acid (PLLA)-chitosan-collagen electrospun tube for vascular graft Application. J Funct Biomater.2018;9(2):32. https://doi.org/10.3390/jfb9020032.

14. Rosellini E., Barbani N., Lazzeri L., Cascone M.G. Biomimetic and bioactive small diameter tubular scaffolds for vascular tissue engineering. Biomimetics (Basel). 2022;7(4):199. https://doi.org/10.3390/biomimetics7040199.

15. Jaffe E.A., Nachman R.L., Becker C.G., Minick C.R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. Clin Invest. 1973; 52: 2745–2756. https://doi.org/10.1172/JCI107470.

16. Ghasemi M., Turnbull T., Sebastian S., Kempson I. The MTT Assay: utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int. J. Mol. Sci. 2021;22:12827. https://doi.org/10.3390/ijms222312827.

17. Великанова Е.А., Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Антонова Л.В. Влияние напряжения сдвига на свойства колониеформирующих эндотелиальных клеток в сравнении с эндотелиальными клетками коронарных артерий. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2022; 11(4):90-97. https://doi.org/10.17802/2306-1278-2022-11-4-90-97.

18. Li W., Zhou J., Xu Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomed Rep. 2015;3(5):617-620. https://doi.org/10.3892/br.2015.481.