СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В СОСТАВЕ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКТОВ В ПРОЦЕССЕ РЕГЕНЕРАЦИИ: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ

Основные положения

Предложен способ определения жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток в составе тканеинженерных конструктов, который может стать эффективным инструментом регенеративной медицины и тканевой инженерии для оценки механизмов регенеративного процесса при использовании данных конструктов и прогнозировании их эффективности в системе in vitro.

Резюме

Цель. Экспериментальное обоснование эффективности способа определения жизнеспособности мезенхимальных стволовых клеток в составе тканеинженерных конструктов (ТИК) в процессе регенерации.

Материалы и методы. Экспериментальное исследование проведено на 12 животных (самцы крыс). Животным формировали полнослойную скальпированную рану диаметром 3 см. В рану имплантировали ТИК на основе криопреципитата плазмы крови человека, в состав которого вводили суспензию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) крыс, предварительно окрашенных трейсером DiOC₁₄(3). В контрольные сроки (3, 7–8, 14 и 21-е сутки) животные были выведены из эксперимента. В ходе операции вырезалась область раневого дефекта для проведения ex tempore исследования методом широкопольной флуоресцентной микроскопии с визуализацией образцов с 40, 100 и 200-кратным увеличением по GFP-каналу флуоресценции.

Результаты. При исследовании материала, полученного от животных на 3-и сутки, внешние характеристики подавляющего большинства выявленных объектов с флуоресцентным свечением соответствовали морфологическим характеристикам МСК – веретенообразные клетки с характерными отростками. В материале, полученном от экспериментальных животных на 7–8 сутки, также выявляли большое количество клеток, окрашенных трассирующим флуоресцентным мембранным красителем, которые имели зеленое флуоресцентное свечение и характерную морфологию. В биоматериале, полученном на 14 сутки эксперимента, количество объектов с характерной для МСК морфологией, окрашенных трейсером DiOC₁₄(3), значительно меньше, чем на 3 и 7–8 сутки эксперимента. На 21 сутки также детектировали сигнал, специфический для трейсера DiOC₁₄(3), однако визуализировать хотя бы единичные клетки с характерной для МСК морфологией не удалось, вероятно, сигнал был обусловлен фрагментами мембран, элиминированных МСК, меченных флуоресцентным красителем.

Заключение. Показано, что МСК в имплантированном на рану животного ТИК сохраняют жизнеспособность и характерную морфологию как минимум в течение 14 суток. Важно, что предложенный способ позволяет прижизненно визуализировать и фотофиксировать жизнеспособные МСК с характерной морфологией, и таким образом, избежать искажений, которые могут быть связаны с фиксацией биологического материала. Предложенный способ может стать эффективным инструментом регенеративной медицины и тканевой инженерии в отношении оценки механизмов регенеративного процесса при использовании ТИК и прогнозирования их эффективности в системе in vitro.

1. Файзуллин А.Л., Шехтер А.Б., Истранов Л.П., Истранова Е.В., Руденко Т.Г., Гуллер А.Е., Абоянц Р.К., Тимашев П.С., Бутнару Д.В. Биорезорбируемые коллагеновые материалы в хирургии: 50 лет успеха. Сеченовский вестник. 2020; 11(1): 59–70. doi.org/10.47093/2218-7332.2020.11.1.59-70

2. Bian D., Wu Y., Song G., Azizi R., Zamani A. The application of mesenchymal stromal cells (MSCs) and their derivative exosome in skin wound healing: a comprehensive review. Stem Cell Res Ther. 2022;13(1):1-17. doi:10.1186/s13287-021-02697-9

3. Heldring N., Mäger I., Wood M.J.A., Le Blanc K, Andaloussi S.E.L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Hum Gene Ther. 2015;26(8):506-517. doi:10.1089/hum.2015.072

4. Gomzikova M.О., James V., Rizvanov A. A. Therapeutic Application of Mesenchymal Stem Cells Derived Extracellular Vesicles for Immunomodulation. Front Immunol. 2019;10(November):1-9. doi:10.3389/fimmu.2019.02663

5. Dedier M., Magne B., Nivet M., Banzet S., Trouillas M. Anti-inflammatory effect of interleukin-6 highly enriched in secretome of two clinically relevant sources of mesenchymal stromal cells. Front Cell Dev Biol. 2023;11(September):1-8. doi:10.3389/fcell.2023.1244120

6. Mendt M., Rezvani K., Shpall E. Mesenchymal stem cell-derived exosomes for clinical use. Bone Marrow Transplant. 2019;54:789-792. doi:10.1038/s41409-019-0616-z

7. Lotfy A., AboQuella N.M., Wang H. Mesenchymal stromal/stem cell (MSC)-derived exosomes in clinical trials. Stem Cell Res Ther. 2023;14(1):1-18. doi:10.1186/s13287-023-03287-7

8. Lin Y., Marin-Argany M., Dick C.J., Redhage K.R., Blancas-Mejia L.M., Bulur P., Butler G.W., Deeds M.C., Madden B.J., Williams A., Wall J.S., Dietz A., Ramirez-Alvarado M. Mesenchymal stromal cells protect human cardiomyocytes from amyloid fibril damage. Cytotherapy. 2017;19(12). doi:10.1016/j.jcyt.2017.08.021

9. Hashemi S.S., Pourfath M.R., Derakhshanfar A., Behzad-Behbahani A., Moayedi J. The role of labeled cell therapy with and without scaffold in early excision burn wounds in a rat animal model. Iran J Basic Med Sci. 2020;23(5):673-679. doi:10.22038/ijbms.2020.34324.8156

10. Marino G., Moraci M., Armenia E., Orabona C., Sergio R., De Sena G., Capuozzo V., Barbarisi M., Rosso F., Giordano G., Iovino F., Barbarisi A. Therapy with autologous adipose-derived regenerative cells for the care of chronic ulcer of lower limbs in patients with peripheral arterial disease. J Surg Res. 2013 Nov;185(1):36-44. doi: 10.1016/j.jss.2013.05.024

11. Зиновьев Е.В., Крайнюков П.Е., Асадулаев М.С., Костяков Д.В., Вагнер Д.О., Крылов П.К., Османов К.Ф. Клиническая оценка эффективности применения мезенхимальных стволовых клеток при термических ожогах Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова 2018;13(4): 62-67. doi:10.25881/bpnmsc.2018.88.91.011

12. Еремеев А.В., Пикина А.С., Владимирова Т.В., Богомазова А.Н. Методы оценки жизнеспособности клеток, культивируемых in vitro в 2D- и 3D-структурах. Гены и клетки. 2023;18(1):5-21. doi:10.23868/gc312198

13. Kamiloglu S., Sari G., Ozdal T., Capanoglu E. Guidelines for cell viability assays. Food Front. 2020;1(3):332-349. doi:10.1002/fft2.44

14. Debruyne A.C., Okkelman I.A., Dmitriev R.I. Balance between the cell viability and death in 3D. Semin Cell Dev Biol. 2023;144:55-66. doi:10.1016/J.SEMCDB.2022.09.005

15. Gantenbein-Ritter B., Potier E., Zeiter S., van der Werf M., Sprecher C.M., Ito K. Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds. Tissue Eng - Part C Methods. 2008;14(4):353-358. doi:10.1089/ten.tec.2008.0313

16. Dominijanni A.J., Devarasetty M., Forsythe S.D., Votanopoulos K.I., Soker S. Cell Viability Assays in Three-Dimensional Hydrogels: A Comparative Study of Accuracy. Tissue Eng - Part C Methods. 2021;27(7):401-410. doi:10.1089/ten.tec.2021.0060

17. Dittmar R., Potier E., van Zandvoort M., Ito K. Assessment of cell viability in three-dimensional scaffolds using cellular auto-fluorescence. Tissue Eng - Part C Methods. 2012;18(3):198-204. doi:10.1089/ten.tec.2011.0334

18. Bonnier F., Keating M.E., Wróbel T.P., Majzner K., Baranska M., Garcia-Munoz A., Blanco A., Byrne H.J. Cell viability assessment using the Alamar blue assay: a comparison of 2D and 3D cell culture models. Toxicol In vitro. 2015;29(1):124-31. doi: 10.1016/j.tiv.2014.09.014

19. Семенычева Л.Л., Кузнецова Ю.Л., Валетова, Н.Б., Гераськина Е.В., Таранкова О.А. Способ получения уксусной дисперсии высокомолекулярного рыбного коллагена. Патент RU2567171C1, 2015; Бюл. №31

20. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. Практическое руководство. СПб: СпецЛит; 2010. 95 с.

21. Guo S., Dipietro L.A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 2010;89(3):219-229. doi:10.1177/0022034509359125

22. Gonzalez A.C., Costa T.F., Andrade Z.A., Medrado A.R. Wound healing - A literature review. An Bras Dermatol. 2016;91(5):614-620. doi: 10.1590/abd1806-4841.20164741

23. Юрова К.А., Мелащенко Е.С., Хазиахматова О.Г., Малащенко В.В., Мелащенко О.Б., Шунькин Е.О., Норкин И.К., Хлусов И.А., Литвинова Л.С. Мезенхимные стволовые клетки: краткий обзор классических представлений и новых факторовостеогенной дифференцировки (PDF) Мезенхимальные стволовые клетки: краткий обзор концепций классификации и новых факторов остеогенной дифференцировки. Медицинская иммунология, 2021;23(2):207-222. doi:10.15789/1563-0625-MSC-2128

24. Макаревич П.И. Клеточные пласты из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток как платформа для тканевой инженерии в регенеративной медицине. Дисс. …д.м.н. М; 2024.

25. Nourian Dehkordi A., Mirahmadi Babaheydari F., Chehelgerdi M., Raeisi Dehkordi S. Skin tissue engineering: wound healing based on stem-cell-based therapeutic strategies. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):111. doi: 10.1186/s13287-019-1212-2

26. Воротников А.В., Суздальцева Ю.Г., Рубцов Ю.П., Аниол Н.В., Горюнов К.В., Кудряшова Т.В., Тюрин-Кузьмин П.А., Ткачук В.А. Направленная миграция и мезенхимальные прогениторные клетки: участие в воспалении, репарации и регенерации ткани. В сборнике: Стволовые клетки и регенеративная медицина под ред. В.А Ткачука. М: Макс-пресс; 2012.

27. Бехало В.А., Горская Ю.Ф., Нестеренко В.Г. Иммунорегуляторный и иммунотерапевти-ческий потенциал мезенхимальных стволовых/стромальных клеток: перспективы и проблемы. Иммунология. 2024; 45 (3): 385–395. doi:10.33029/1816-2134-2024-45-3-385-395