ЗАСЕЛЕНИЕ ДЕМИНЕРАЛИЗОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА КЛЕТКАМИ ХОНДРОГЕННОГО РЯДА

Цель Поиск эффективных способов обработки деминерализованной костной ткани после консервации для эффективного заселения хондроцитами. Материалы и методы В качестве материала исследования использовали деминерализованный костный матрикс размером 1 х 1 х 1 см³. Для удаления цитотоксических веществ из матриц разработан способ очистки, заключающийся в поэтапном замачивании образца в Н₂О, растворе 0,1 Н NaOH, растворе 1 н NaOH, Н₂О и DPBS до нейтрального pH. Для улучшения клеточной адгезии на матрицах, на последние перед заселением воздействовали ультразвуком. На образец, прошедший химическую очистку 3 раза, воздействовали ультразвуком в течение 1 минуты и W = 5. После каждого воздействия, воду в емкости меняли. После этого воду в емкости сменили на DPBS и обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты и W = 5. После окончания процедур образец находился в нейтральной среде (pH 7,0). Обработанные таким способом матрицы заселяли клетками. В качестве источника клеток для заселения, была выбрана ткань гиалинового хряща мини-поросенка. Хондроциты выделяли стандартным способом с применением коллагеназы II типа и культивировали в течение 20 суток в культуральных флаконах. Матрицы заселяли хондроцитами 1 пассажа. Для повышения эффективности заселения костного матрикса клетками был апробирован способ предварительной обработки деминерализованной костной ткани 1% раствором желатина. Для определения пригодности матрикса к заселению его хондроцитами использовали микротитрационный тест влияния экстракта, получаемого в ходе ультразвуковой обработки матрицы, на жизнеспособность клеток. Тест проводили на лаг- и лог-фазах роста клеток. Воздействие экстракта на клетки длилось 3 суток. Результаты Показано, что обработка хондроцитов экстрактом на этапе лаг-фазы роста культуры оказывает прямой дозозависимый цитотоксический эффект, в отличие от эффекта обработки хондроцитов в фазе логарифмического роста культуры. Показано, что низкая эффективность заселения деминерализованного костного матрикса связана не только с жесткими условиями изготовления ДКМ, но и от условий последующей подготовки матрицы, фазы роста заселяемой клеточной культуры. С увеличением глубины миграции клеток вглубь матрицы нарушается микроциркуляция, что ведет к недостаточному обеспечению клеток в тканеинженерной конструкции питанием и замедлению метаболических процессов. Заключение Эффективность равномерного заселения деминерализованного костного матрикса клетками связана не только с условиями обработки матрикса, выраженным цитотоксическим эффектом, но и с его архитектоникой. Проблема замедления метаболизма клеток в тканеинженерной конструкции решается путем комбинированного метода очистки ДКМ химическим и ультразвуковым способом. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости применении механических и электрических стимулов для нормального функционирования клеток костной и хрящевой ткани внутри матрицы.

1. Больбасов Е.Н., Антонова Л.В., Матвеева В.Г. и др. Изменение поверхностных свойств и биосовместимости матриксов из поликапролактона, модифицированнх плазмой высокочастотного магнетронного разряда. Биомедицинская химия 2016; 62 (1): 56-63 doi: 10.18097/PBMC20166201056

2. Кузнецова Д.С., Тимашев П.С., Баграташвили В.Н., Загайнова Е.В. Костные имплантаты на основе скаффолдов и клеточных систем в тканевой инженерии (обзор). Современные технологии в медицине. 2014; 6 (4): 201 – 212.

3. Chan B.P., Leong K.W scaffolding tissue engineering: general approaches and tissue- specific considerations. Eur Spine J. 2008; 17 (Suppl 4): 467 – 479:

4. Александрова С.А., Нащекина Ю.А., Цупкина Н.В. Методологические подходы создания тканеинженерных конструкций для восстановления дефектов костной и хрящевой тканей (опыт Института Цитологии РАН). Клеточные культуры. 2016; 32: 95-104.

5. Kirilova I.A., Sharkeev Yu.P., Nikolaev S.V. Physicomechanical properties of the extracellular matrix of a demineralized bone. AIP Conference Proceedings. 2016; 1760 (1): 020027. doi https://doi.org/10.1063/1.4960246

6. Вахрушев И.В., Антонов Е.Н., Попова А.В. и др. Разработка такнеинженерных имплантов для регенерации костной ткани на основе полилактогликолидных скаффолдов нового поколения и мультипотентных мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба (SHED – клеток). Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012; 1: 29-33.

7. Торгомян А.Л., Гамбарян А.К., Асратян А.А., Худавердян Д.Н. Современные методы восстановления суставного гиалинового хряща при остеоартрите. Медицинская наука Армении НАН РА. 2014; LIV(1): 23- 37.

8. Behrens P., Ehlers E.M., Kochermann K.U., Rohvedel J., Russlies M., Plotz W. New therapy procedure for localized cartilage defects. Encouraging results with autologous chondrocyte implantation. MMW Fortschr. Med., 1999, 141: 49-51.

9. Копелев П.В., Нащекина Ю.А., Александрова С.А. Оценка жизнеспособности хондроцитов кролика при культивировании на полилактидных скаффолдах, предназначенных для тканевой инженерии хрящевой ткани. Бюллетень инновационных технологий (БИТ). 2017; 1 (2): 31-35.

10. Советников Н.Н., Кальсин В.А., Конопляников М.А., Муханов В.В. Клеточные технологии и тканевая инженерия в лечении дефектов суставной поверхности. Клиническая практика. 2013; 1: 52-66.

11. Сергеева Н.С., Комлев В.С., Баринов С.М. и др. Эволюция взглядов на материалы, предназначенные для замещения костно-хрящевых дефектов. Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы VIII Московского Международного Конгресса. ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2015.

12. Pallante A.L., Chen A.C., Ball S.T. et al. The in vivo performance of osteochondral allografts in the goat is diminished with extended storage and decreased cartilage cellularity. Am. J. Sports Med. 2012; 40 (8): 1814-23 doi: 10.1177/0363546512449321

13. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Бозо И.Я. и др. Тканеинже-нерный эквивалент кости: методологические основы создания и биологические свойства. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2011; 6 (1б): 62-67.