Оценка экспрессии провоспалительных цитокинов в гладкомышечных клетках коронарной артерии, экспонированных мутагеном алкилирующего механизма действия

Актуальность. Известно, что повреждение ДНК гладкомышечных клеток может быть триггером их клональной экспансии и трансформации в пенистые клетки. Таким образом, изучение молекулярно-генетических механизмов ответа гладкомышечных клеток сосудов на генотоксическое воздействие представляется важным и актуальным в контексте углубленного понимания механизмов атерогенеза.
Цель. Изучить характер изменения уровня мРНК и концентрации провоспалительных цитокинов IL6 и IL8 в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека, культивируемых в условиях генотоксической нагрузки.
Материалы и методы. Уровень генной экспрессии изучаемых цитокинов в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека оценивали с помощью количественной полимеразной цепной реакции в двух временных точках – непосредственно после 6 ч экспозиции клеток митомицином С (точка 1) и после 6 ч экспозиции мутагеном с последующими 24 ч культивирования клеток в чистой культуральной среде (точка 2). Контролем служили гладкомышечные клетки, культивированные по вышеуказанной схеме без генотоксической нагрузки. В качестве референсных генов использовали HPRT1, GAPDH и B2M. Уровень экспрессии генов интереса рассчитывали по методу ΔCt. Концентрацию IL6 и IL8 в культуральной среде определяли с помощью иммуноферментного анализа в точках 1 и 2. Статистический анализ полученных результатов проводили в программе GraphPad Prism 9.
Результаты. Непосредственно после мутагенного воздействия (точка 1) не выявлено изменения уровня экспрессии генов IL6 и IL8 в гладкомышечных клетках, экспонированных митомицином С, по сравнению с неэкспонированным контролем. После удаления из культур мутагена в экспериментальной группе отмечено снижение уровня мРНК генов IL6 и IL8 по сравнению с контролем (кратность изменения экспрессии составила 0,36 и 0,67 соответственно). При этом достоверных различий концентрации изученных цитокинов в культуральной среде гладкомышечных клеток, экспонированных митомицином С, по сравнению с контролем не выявлено.
Заключение. Генотоксический стресс в гладкомышечных клетках коронарной артерии человека, вызванный алкилирующим мутагеном митомицином С, приводит к изменению профиля генной экспрессии, но не концентрации провоспалительных цитокинов IL6 и IL8. Таким образом, воздействие митомицина С на гладкомышечные клетки не приводит к формированию ими провоспалительного фенотипа.

1. Libby P., Ridker P.M., Hansson G.K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature. 2011;473(7347):317-325. doi: 10.1038/nature10146.

2. Bentzon J.F., Otsuka F., Virmani R., Falk E. Mechanisms of plaque formation and rupture. Circ Res. 2014;114(12):1852-1866. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.114.302721.

3. Pulliero A., Godschalk R., Andreassi M.G., Curfs D., Van Schooten F.J., Izzotti A. Environmental carcinogens and mutational pathways in atherosclerosis. Int J Hyg Environ Health. 2015;218(3):293-312. doi: 10.1016/j.ijheh.2015.01.007.

4. Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017;(1):92-101. doi: 10.17802/2306-1278-2017-1-92-101.

5. Binková B., Smerhovský Z., Strejc P., Boubelík O., Stávková Z., Chvátalová I., Srám R.J. DNA-adducts and atherosclerosis: a study of accidental and sudden death males in the Czech Republic. Mutat Res. 2002;501(1-2):115-128. doi: 10.1016/s0027-5107(02)00019-2.

6. Nair J., De Flora S., Izzotti A., Bartsch H. Lipid peroxidation-derived etheno-DNA adducts in human atherosclerotic lesions. Mutat Res. 2007;621(1-2):95-105. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2007.02.013.

7. GBD 2017 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories, 1980-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 2018;392(10159):1736-1788. doi: 10.1016/S0140-6736(18)32203-7.

8. Rosefort C., Fauth E., Zankl H. Micronuclei induced by aneugens and clastogens in mononucleate and binucleate cells using the cytokinesis block assay. Mutagenesis. 2004;19(4):277-284. doi: 10.1093/mutage/geh028.

9. Lorge E., Thybaud V., Aardema M.J., Oliver J., Wakata A., Lorenzon G., Marzin D. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutat Res. 2006;607(1):13-36. doi: 10.1016/j.mrgentox.2006.04.006.

10. Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., Mueller R., Nolan T., Pfaffl M.W., Shipley G.L., Vandesompele J., Wittwer C.T. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.

11. Weakley S.M., Jiang J., Kougias P., Lin P.H., Yao Q., Brunicardi F.C., Gibbs R.A., Chen C. Role of somatic mutations in vascular disease formation. Expert Rev Mol Diagn. 2010;10(2):173-185. doi: 10.1586/erm.10.1.

12. Kirsch-Volders M., Bonassi S., Knasmueller S., Holland N., Bolognesi C., Fenech M.F. Commentary: critical questions, misconceptions and a road map for improving the use of the lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for in vivo biomonitoring of human exposure to genotoxic chemicals-a HUMN project perspective. Mutat Res. 2014;759:49-58. doi: 10.1016/j.mrrev.2013.12.001.

13. Stone M.P., Cho Y.J., Huang H., Kim H.Y., Kozekov I.D., Kozekova A., Wang H., Minko I.G., Lloyd R.S., Harris T.M., Rizzo C.J. Interstrand DNA cross-links induced by alpha, beta-unsaturated aldehydes derived from lipid peroxidation and environmental sources. Acc Chem Res. 2008;41(7):793-804. doi: 10.1021/ar700246x.

14. Lee Y.J., Park S.J., Ciccone S.L., Kim C.R., Lee S.H. An in vivo analysis of MMC-induced DNA damage and its repair. Carcinogenesis. 2006;27(3):446-53. doi: 10.1093/carcin/bgi254.

15. Sinitsky M.Y., Kutikhin A.G., Tsepokina A.V., Shishkova D.K., Asanov M.A., Yuzhalin A.E., Minina V.I., Ponasenko A.V. Mitomycin C induced genotoxic stress in endothelial cells is associated with differential expression of proinflammatory cytokines. Mutat Res. 2020;858-860:503252. doi: 10.1016/j.mrgentox.2020.503252.

16. Синицкий М.Ю., Цепокина А.В., Кутихин А.Г., Шишкова Д.К., Понасенко А.В. Профиль генной экспрессии в эндотелиальных клетках, культивируемых в присутствии митомицина C. Биомедицинская химия. 2021;67(2):130-136. doi: 0.18097/pbmc20216702130

17. Cai Q., Lanting L., Natarajan R. Growth factors induce monocyte binding to vascular smooth muscle cells: implications for monocyte retention in atherosclerosis. Am J Physiol Cell Physiol. 2004;287:707-714. doi: 10.1152/ajpcell.00170.2004.

18. Lim S., Park S. Role of vascular smooth muscle cell in the inflammation of atherosclerosis. BMB Rep. 2014;47(1):1-7. doi: 10.5483/bmbrep.2014.47.1.285.

19. Lee G.L., Chang Y.W., Wu J.Y., Wu M.L., Wu K.K., Yet S.F., Kuo C.C. TLR 2 induces vascular smooth muscle cell migration through cAMP response element-binding protein-mediated interleukin-6 production. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32:2751-2760. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.300302.

20. Yang X., Coriolan D., Murthy V., Schultz K., Golenbock D.T., Beasley D. Proinflammatory phenotype of vascular smooth muscle cells: role of efficient Toll-like receptor 4 signaling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005;289:1069-1076. doi: 10.1152/ajpheart.00143.2005.

21. Lee J.H., Joo J.H., Kim J., Lim H.J., Kim S., Curtiss L., Seong J.K., Cui W, Yabe-Nishimura C., Bae Y.S. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc Res. 2013;99:483-493. doi: 10.1093/cvr/cvt107.

22. Nilsson J. Cytokines and smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 1993;27(7):1184-1190. doi: 10.1093/cvr/27.7.1184.

23. Romano M., Sironi M., Toniatti C., Polentarutti N., Fruscella P., Ghezzi P., Faggioni R., Luini W., van Hinsbergh V., Sozzani S., Bussolino F., Poli V., Ciliberto G., Mantovani A. Role of IL-6 and its soluble receptor in induction of chemokines and leukocyte recruitment. Immunity. 1997;6(3):315-325. doi: 10.1016/s1074-7613(00)80334-9.

24. Apostolakis S., Vogiatzi K., Amanatidou V., Spandidos D.A. Interleukin 8 and cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 2009;84(3):353-360. doi: 10.1093/cvr/cvp241.