Влияние способа полимеризации на свойства фибриновых матриц (пилотное исследование in vitro)

Основные положения. Нами предложен и запатентован способ получения полностью аутологичного фибрина без использования экзогенного тромбина, который представляет интерес для реализации персонифицированного подхода в тканевой инженерии. Такой фибрин помимо отсутствия риска переноса инфекции и запуска иммунных реакций обладает большими прочностью и устойчивостью к деградации, а также лучшей гемосовместимостью по сравнению с фибрином, полимеризованным с помощью экзогенного тромбина, что является несомненным преимуществом при его применении в качестве модифицирующего покрытия протезов сосудов малого диаметра.

Актуальность. Аутологичный фибрин может выступать в качестве модифицирующего покрытия для придания биомиметических свойств различным полимерам, используемым в сосудистой инженерии. Традиционно полимеризацию фибриногена выполняют с помощью внесения экзогенного тромбина и хлорида кальция. Запатентованный нами способ получения фибрина без экзогенного тромбина позволяет получить полностью аутологичный материал, не имеющий риска переноса инфекций. Различия в способах полимеризации могут менять свойства фибрина.

Цель. Сравнить наиболее важные для сосудистой инженерии свойства фибрина, полученного различными способоми: с использованием эндогенного (ФЭнТр) и экзогенного (ФЭкТр) тромбина in vitro.

Материалы и методы. Преципитат фибриногена выделяли методом этаноловой преципитации с низкой концентрацией этанола. Содержание фибриногена в преципитате нормировали до конечной концентрации в фибрине 30 мг/мл. Полимеризацию ФЭкТр выполняли путем внесения в преципитат 50 МЕ/мл тромбина  и 0,2% хлорида кальция, ФЭнТр – только добавлением 0,2% хлорида кальция. Прочностные свойства образцов тестировали на разрывной машине Z (Zwick/Roell). Структуру фибрина изучали с помощью сканирующей электронной микроскопии, проводили количественный анализ размера пор и волокон, плотность точек ветвления. Количественное содержание XIII фактора в плазме и полученном преципитате определяли методом иммуноферментного анализа. Активность XIII фактора исследовали по формированию γ-γ-сшивок методом SDS-PAGE, устойчивости образцов к протеолитической и фибринолитической деградации. Оценивали способность ФЭнТр и ФЭкТр активировать контактную коагуляцию и агрегацию тромбоцитов.

Результаты. В структуре образцов ФЭнТр преобладали более тонкие волокна, при этом образцы отличались большими прочностью и жесткостью. Описанные особенности могут быть связаны с более эффективной активацией XIII фактора, что подтверждается формированием большего количества γ-γ-димеров в образцах ФЭнТр, а также устойчивостью к протеолитической деградации по сравнению с ФЭкТр. Кроме того, образцы ФЭнТр in vitro меньше активировали тромбоциты по сравнению с ФЭкТр.

Заключение. Способ полимеризации фибрина с помощью эндогенного тромбина позволяет получить полностью аутологичный материал, который, по сравнению с фибрином, полимеризованным традиционным способом, обладает лучшими физико-механическими свойствами, стойкостью к протеолитической деградации и более низкой тромбогенностью.

1. Fang S., Ellman D.G., Andersen D.C. Review: Tissue Engineering of Small-Diameter Vascular Grafts and Their In Vivo Evaluation in Large Animals and Humans. Cells. 2021; 10: 713. doi: 10.3390/cells10030713.

2. Антонова Л.В., Матвеева В.Г., Великанова Е.А., Ханова М.Ю., Севостьянова В.В., Цепокина А.В., Эльгудин Я.Л., Барбараш Л.С. Оценка in vitro активности ростовых факторов и хемоаттрактантных молекул, инкорпорированных в полимерные матриксы на основе полигидроксибутирата/ валерата и поликапролактона. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2018; 7(2): 89-101. doi: 10.17802/2306-1278-2018-7-2-89-101

3. Song H.G, Rumma R.T., Ozaki C.K., Edelman E.R., Chen C.S. Vascular Tissue Engineering: Progress, Challenges, and Clinical Promise. Cell Stem Cell. 2018; 22 (3): 340-354. doi: 10.1016/j.stem.2018.02.00910.

4. Pashneh-Tala S., MacNeil S., Claeyssens F. The Tissue-Engineered Vascular Graft-Past, Present, and Future. Tissue Eng Part B Rev. 2016; 22 (1): 68-100. doi: 10.1089/ten.teb.2015.0100

5. Mariani E., Lisignoli G., Borzì R.M., Pulsatelli L. Biomaterials: Foreign Bodies or Tuners for the Immune Response. Int J Mol Sci. 2019; 20 (3): 636. doi: 10.3390/ijms20030636.

6. Mallis P., Kostakis A., Stavropoulos-Giokas C., Michalopoulos E. Future Perspectives in Small-Diameter Vascular Graft Engineering. Bioengineering (Basel) 2020; 7(4): 160. doi: 10.3390/bioengineering7040160.

7. Egorikhina M.N., Aleynik D.Ya., Rubtsova Y.P., Levin G.Ya., Charykova I.N., Semenycheva L.L., Bugrova M.L., Zakharychev E.A. Hydrogel scaffolds based on blood plasma cryoprecipitate and collagen derived from various sources: Structural, mechanical and biological characteristics. Bioact. Mater. 2019; 4: 334-345. doi: 10.1016/j.bioactmat.2019.10.003.

8. Podolnikova N.P., Yakovlev S., Yakubenko V.P., Wang X., Gorkun O.V., Ugarova T.P. The interaction of integrin αIIbβ3 with fibrin occurs through multiple binding sites in the αIIb β-propeller domain. J Biol Chem. 2014; 289 (4): 2371-2383. doi: 10.1074/jbc.M113.518126.

9. Egorikhina M.N., Rubtsova Y.P., Charykova I.N., Bugrova M.L., Bronnikova I.I., Mukhina P.A., Sosnina L.N., Aleynik D.Y. Biopolymer Hydrogel Scaffold as an Artificial Cell Niche for Mesenchymal Stem Cells. Polymers (Basel). 2020; 12(11): 2550. doi: 10.3390/polym12112550.

10. Chlupáč J., Filová E., Riedel T., Houska M., Brynda E., Remy-Zolghadri M., Bareille R., Fernandez P., Daculsi R., Bourget C., Bordenave L., Bačáková L. Attachment of human endothelial cells to polyester vascular grafts: pre-coating with adhesive protein assemblies and resistance to short-term shear stress. Physiol Res. 2014; 63 (2): 167-177. doi: 10.33549/physiolres.932577.

11. Lo C.Y., Jones C., Glader B., Zehnder J.L. Development of antibodies to human thrombin and factor V in a pediatric patient exposed to topical bovine thrombin. Pediatr Blood Cancer. 2010; 55 (6): 1195-1197. doi: 10.1002/pbc.22699.

12. Diesen D.L., Lawson J.H. Bovine thrombin: history, use, and risk in the surgical patient. Vascular. 2008, Suppl 1: S29-36. Erratum in: Vascular. 2009; 17 (3): 181. PMID: 18544303

13. Способ изготовления аутологичного фибрина с регулируемым содержанием фибриногена без использования экзогенного тромбина. патент RU 2758260 C1. Антонова Л.В., Матвеева В.Г., Ханова М.Ю., Барбараш О.Л., Барбараш Л.С. Дата регистрации: 27.10.2021.

14. Standeven K.F., Carter A.M., Grant P.J., Weisel J.W., Chernysh I., Masova L., Lord S.T., Ariëns R.A. Functional analysis of fibrin {gamma}-chain cross-linking by activated factor XIII: determination of a cross-linking pattern that maximizes clot stiffness. Blood. 2007; 110 (3): 902-907. doi: 10.1182/blood-2007-01-066837.

15. Weis-Fogh U.S. Fibrinogen prepared from small blood samples for autologous use in a tissue adhe sive system. Eur Surg Res. 1988; 20 (5-6): 381-389. doi: 10.1159/000128789.

16. Dietrich M., Heselhaus J., Wozniak J., Weinandy S., Mela P., Tschoeke B., Schmitz-Rode T., Jockenhoevel S. Fibrin-based tissue engineering: comparison of different methods of autologous fibrinogen isolation. Tissue Eng Part C Methods. 2013; 19 (3): 216-226. doi: 10.1089/ten.TEC.2011.0473.

17. Casali B., Rodeghiero F., Tosetto A., Palmieri B., Immovilli R., Ghedini C., Rivasi P. Fibrin glue from single-donation autologous plasmapheresis. Transfusion. 1992; 32(7): 641-643. doi: 10.1046/j.1537-2995.1992.32792391037.x.

18. Ismail A.E. Purification of fibrinogen from human plasma. Chemical & Biomolecular Engineering Theses 2012, Dissertations, & Student Research 13. Available at: https://digitalcommons.unl.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1012&context=chemengtheses (accessed 09.10.2021)

19. Ariëns R.A.S., Lai T.S., Weisel J.W., Greenberg C.S., Grant P.J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood 2002; 100: 743-754. doi: 10.1182/blood.V100.3.743.

20. Weisel J.W., Litvinov R.I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 2013; 121(10): 1712-1719. doi:10.1182/blood-2012-09-306639

21. Collet J.P., Shuman H., Ledger R.E., Lee S., Weisel J.W. The elasticity of an individual fibrin fiber in a clot. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102, (26): 9133-9137. doi: 10.1073/pnas.0504120102.

22. Ryan E.A., Mockros L.F., Stern A.M., Lorand L. Influence of a natural and a synthetic inhibitor of factor XIIIa on fibrin clot rheology. Biophys. J 1999; 77 (5): 2827-2836. doi: 10.1016/S0006-3495(99)77114-6.

23. Li W., Sigley J., Pieters M., Helms C.C., Nagaswami C., Weisel J.W., Guthold M. Fibrin Fiber Stiffness Is Strongly Affected by Fiber Diameter, but Not by Fibrinogen Glycation. Biophys J. 2016; 110 (6): 1400-1410. doi: 10.1016/j.bpj.2016.02.021.

24. Hethershaw E.L., Cilia La Corte A.L., Duval C., Ali M., Grant P.J., Ariens R.A., Philippou H. The effect of blood coagulation factor XIII on fibrin clot structure and fibrinolysis. J Thromb Haemost. 2014; 12: 197-205. doi: 10.1111/jth.12455.

25. Rijken D.C., Abdul S., Malfliet J.J., Leebeek F.W., Uitte de Willige S. Compaction of fibrin clots reveals the antifibrinolytic effect of factor XIII. J Thromb Haemost. 2016; 14 (7): 1453-1461. doi: 10.1111/jth.13354.

26. Collet J.P., Park D., Lesty C., Soria J., Soria C., Montalescot G., Weisel J.W. Influence of fibrin network conformation and fibrin fiber diameter on fibrinolysis speed: dynamic and structural approaches by confocal microscopy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20: 1354-1361. doi: 10.1161/01.ATV.20.5.1354.

27. Mutch N.J., Engel R., de Uitte W.S., Philippou H., Ariens R.A. Polyphosphate modifies the fibrin network and down-regulates fibrinolysis by attenuating binding of tPA and plasminogen to fibrin. Blood 2010; 115 (19): 3980-3988. doi: 10.1182/blood-2009-11-254029.

28. Fraser S.R., Booth N.A., Mutch N.J. The antifibrinolytic function of factor XIII is exclusively expressed through alpha(2)-antiplasmin cross-linking. Blood 2011; 117: 6371-6374. doi: 10.1182/blood-2011-02-333203.