ЭФФЕКТИВНОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА В ОЦЕНКЕ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ, ПРОШЕДШИХ ПРЕКЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ НА ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ

Основные положения

• Разработаны мультиплексные панели иммунофлуоресцентной визуализации для мониторинга ремоделирования тканеинженерных сосудистых протезов у павианов с применением человек‑специфических антител.
• С помощью сканирующей лазерной микроскопии подтверждено, что антитела позволяют детектировать ключевые элементы новообразованной сосудистой ткани спустя 6 месяцев после имплантации протезов в бедренные артерии павианов. Среди выявленных элементов – эндотелиальные клетки, внеклеточный матрикс, гладкомышечноподобные и фибробластоподобные клетки.
• Ремоделированная ткань, сформированная на основе ТСП, по многим параметрам схожа с нативной сосудистой стенкой. Это подтверждает эффективность разработанных панелей для преклинических испытаний и расширяет возможности детекции процессов ремоделирования у моделей павианов.

Цель. Разработка панелей иммунофлуоресцентного исследования на основе человек-специфических антител для возможности расширения детекции ремоделирования тканеинженерных конструкций в ходе преклинических испытаний на модели павианов.

Материалы и методы. Выполнена сравнительная оценка чувствительности иммунофлуоресцентных антител на образцах интактных внутренних грудных артерий человека и образцах эксплантированных тканеинженерных сосудистых протезов (ТСП), имплантированных в бедренные артерии павианов на 6 месяцев. Доказана таргетность человек-специфических антител CD31, vWF, Coll IV, α-SMA и Vimentin в отношении павианов. Разработаны панели флуоресцентной визуализации ремоделирования ТСП. Интенсивность флуоресценции оценивали с помощью сканирующей лазерной микроскопии. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Prism 8.

Результаты. Доказано, что использование человек-специфических антител CD31, vWF, Coll IV, α-SMA и виментин позволило детектировать следующие элементы новообразованной сосудистой ткани, сформированных на основе ТСП спустя 6 месяцев после их имплантации в бедренные артерии павианов: эндотелиальные клетки, внеклеточный матрикс, гладкомышечноподобные и фибробластоподобные клетки.

Заключение. Разработанные мультиплексные панели иммунофлуоресцентной визуализации отразили основные признаки ремоделирования ТСП у павианов, по многим параметрам схожей с нативной сосудистой стенкой, что подтверждает их эффективность для мониторинга формирования новообразованной сосудистой ткани.

1. Antonova, L. V., Sevostianova, V. V., Silnikov, V. N., Krivkina, E. O., Velikanova, E. A., Mironov, A. V., Shabaev, A. R., Senokosova, E. A., Khanova, M. Y., Glushkova, T. V., Akentieva, T. N., Sinitskaya, A. V., Markova, V. E., Shishkova, D. K., Lobov, A. A., Repkin, E. A., Stepanov, A. D., Kutikhin, A. G., & Barbarash, L. S. (2023). Comparison of the Patency and Regenerative Potential of Biodegradable Vascular Prostheses of Different Polymer Compositions in an Ovine Model. International Journal of Molecular Sciences, 24(10), 8540. doi:10.3390/ijms24108540

2. Лапин Б.А., Данилова И.Г. Перспективные направления экспериментального использования обезьян. Вестник Российской академии наук. 2020;90(1):40-46. doi:10.31857/S0869587320010077.

3. Bergmeister H., Podesser B.K. Preclinical In Vivo Assessment of Tissue Engineered Vascular Grafts and Selection of Appropriate Animal Models. In: Walpoth, B.H., Bergmeister, H., Bowlin, G.L., Kong, D., Rotmans, J.I., Zilla, P. (eds) Tissue-Engineered Vascular Grafts. Reference Series in Biomedical Engineering. 2020; 63-93. Springer, Cham. doi:10.1007/978-3-030-05336-9_5.

4. Taylor, C. B., Cox, G. E., Manalo-estrella, P., Southworth, J., Patton, D. E., & Cathcart, C. (1962). Atherosclerosis in rhesus monkeys. II. Arterial lesions associated with hypercholesteremia induced by dietary fat and cholesterol. Archives of pathology, 74, 16–34.

5. Gresham, G. A., Howard, A. N., Mcqueen, J., & Bowyer, D. E. (1965). Atherosclerosis in primates. British journal of experimental pathology, 46(1), 94–103.

6. Clarkson, T. B., Lofland, H. B., Bullock, B. C., Lehner, N. D., St Clair, R., & Prichard, R. W. (1969). Atherosclerosis in some species of New World monkeys. Annals of the New York Academy of Sciences, 162(1), 103–109. doi:10.1111/j.1749-6632.1969.tb56354.x

7. Didisheim, P., Dewanjee, M. K., Kaye, M. P., Frisk, C. S., Fass, D. N., Wahner, H. W., Tirrell, M. V., & Zollman, P. E. (1984). Nonpredictability of long-term in vivo response from short-term in vitro or ex vivo blood-material interactions. Transactions - American Society for Artificial Internal Organs, 30, 370–376.

8. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., & Yong, W. H. (2019). An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1897, 299–311. doi:10.1007/978-1-4939-8935-5_26

9. Wang, J., Guo, Y., Xu, D., Cui, J., Wang, Y., Su, Y., Liu, Y., Shen, Y., Jing, X., & Bai, W. (2022). The immunolocalization of cluster of differentiation 31, phalloidin and alpha smooth muscle actin on vascular network of normal and ischemic rat brain. Scientific reports, 12(1), 22288. doi:10.1038/s41598-022-26831-6

10. Saper C. B. (2009). A guide to the perplexed on the specificity of antibodies. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society, 57(1), 1–5. doi:10.1369/jhc.2008.952770

11. How to choose and use antibodies | Abcam. https://www.abcam.com/en-us/technical-resources/guides/antibody-basics/how-to-choose-and-use-antibodies (accessed 17.12.2025) (In Engl.)

12. Smith, L. E., Smallwood, R., & Macneil, S. (2010). A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy research and technique, 73(12), 1123–1133. doi:10.1002/jemt.20859

13. Elliott A. D. (2020). Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current protocols in cytometry, 92(1), e68. doi:10.1002/cpcy.68

14. Zhu, J., & Kaufman, L. J. (2014). Collagen I self-assembly: revealing the developing structures that generate turbidity. Biophysical journal, 106(8), 1822–1831. doi:10.1016/j.bpj.2014.03.011

15. Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., & Yang, Y. (2017). Current State-of-the-Art 3D Tissue Models and Their Compatibility with Live Cell Imaging. Advances in experimental medicine and biology, 1035, 3–18. doi:10.1007/978-3-319-67358-5_1

16. López-Chicón, P., Riba-Tietz, T., Fariñas, O., Gelber, P. E., Casaroli-Marano, R. P., & Vilarrodona, A. (2022). A Comparative Study Using Fluorescent Confocal Microscopy and Flow Cytometry to Evaluate Chondrocyte Viability in Human Osteochondral Allografts. Bioengineering (Basel, Switzerland), 9(10), 515. doi:10.3390/bioengineering9100515

17. Poole, J. J. A., & Mostaço-Guidolin, L. B. (2021). Optical Microscopy and the Extracellular Matrix Structure: A Review. Cells, 10(7), 1760. doi:10.3390/cells10071760

18. Wu, Y., & Wagner, W. D. (2024). Syndecan-4 Functionalization Reduces the Thrombogenicity of Engineered Vascular Biomaterials. Annals of biomedical engineering, 52(7), 1873–1882. doi:10.1007/s10439-023-03199-w

19. Senokosova E.A., Krivkina E.O., Mironov A.V., Sardin E.S., Sergeeva T.Yu., Matveeva V.G., Khanova M.Yu., Torgunakova E.A., Mukhamadiyarov R.A., Antonova L.V. Results of preclinical tests of small-diameter tissue engineered vascular grafts on the primate model. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2024;13(4):90-103. doi:10.17802/2306-1278-2024-13-4-90-103

20. Naito, Y., Williams-Fritze, M., Duncan, D. R., Church, S. N., Hibino, N., Madri, J. A., Humphrey, J. D., Shinoka, T., & Breuer, C. K. (2012). Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells, tissues, organs, 195(1-2), 60–72. doi:10.1159/000331405

21. Fayon, A., Menu, P., & El Omar, R. (2021). Cellularized small-caliber tissue-engineered vascular grafts: looking for the ultimate gold standard. NPJ Regenerative medicine, 6(1), 46. doi:10.1038/s41536-021-00155-x