УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ПРИЗНАКИ НОРМАЛЬНЫХ И ДИСФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК АОРТЫ КРЫСЫ

Основные положения

• Принципиальным признаком, отличающим нормальные эндотелиальные клетки от дисфункциональных, является их ориентация вдоль направления потока крови при отсутствии цитоплазматических или мембранных дефектов.
• Основными признаками дисфункциональных эндотелиальных клеток являются шарообразная форма (свидетельствующая о потере клеточной ориентации вдоль направления потока крови), вакуолизация цитоплазмы, нарушение целостности плазматической мембраны, снижение контрастности между ядром и цитоплазмой и частичное открепление эндотелиальной клетки от базальной мембраны.
• Состояние органелл (митохондрий, пластинчатого комплекса и эндоплазматической сети) и нарушения целостности базальной мембраны не являются чувствительными или специфичными признаками дисфункциональных эндотелиальных клеток в сравнении с вышеуказанными.

Цель. Анализ электронно-микроскопических признаков нормальных и дисфункциональных эндотелиальных клеток на примере нисходящей части аорты крысы (характеризующейся ламинарным потоком крови).

Материалы и методы. Исследование проведено на 5 самцах крыс Wistar (возраст ~6 мес., масса тела ~500 г). Фрагменты нисходящей части аорты фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде и постфиксировали в 1% солевом растворе тетраоксида осмия с 1,5% ферроцианидом калия, инкубировали с 1% тиокарбогидразидом, окрашивали в 2% водном растворе тетраоксида осмия, контрастировали в 1% фосфорно-вольфрамовой кислоте, окрашивали 2% триацетатом гадолиния, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, изопропаноле и ацетоне и пропитывали в смеси ацетона и эпоксидной смолы, а затем в чистой эпоксидной смоле Araldite 502 с ее последующей полимеризацией. После шлифовки и полировки образцы аорт были контрастированы цитратом свинца, напылены углеродом и визуализированы посредством сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах.

Результаты. Электронно-микроскопический анализ позволил выделить три основных морфотипа нормальных эндотелиальных клеток: 1) вытянутая вдоль направления потока крови форма и продолговатое ядро; 2) полукруглая форма и овальное, круглое, бобовидное или полиморфное ядро с менее выраженной, но ясно видимой ориентацией вдоль направления потока крови; 3) крупное ядро и еще менее выраженная, но видимая ориентация вдоль направления потока крови. Базальная мембрана нормальных эндотелиальных клеток часто содержала различные дефекты. Дисфункциональные эндотелиальные клетки также имели несколько морфотипов, которые характеризовались сочетанием следующих признаков: приобретение шаровидной формы и потеря ориентации клетки вдоль направления потока крови, вакуолизация цитоплазмы, нарушение целостности плазматической мембраны, снижение контрастности между ядром и цитоплазмой и частичное открепление эндотелиальной клетки от базальной мембраны. При этом в дисфункциональных эндотелиальных клетках зачастую не наблюдалось выраженного изменения структуры органелл или прилегающей к ним базальной мембраны.

Заключение. Сохранение ориентации эндотелиальных клеток вдоль направления потока крови свидетельствует об их нормальном фенотипе при отсутствии иных признаков дисфункциональных эндотелиальных клеток (вакуолизации цитоплазмы, нарушения целостности плазматической мембраны, снижения контрастности между ядром и цитоплазмой и частичного открепления эндотелиальной клетки от базальной мембраны).

1. Cahill P.A., Redmond E.M. Vascular endothelium - Gatekeeper of vessel health. Atherosclerosis. 2016;248:97-109. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2016.03.007.

2. Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Velikanova E.A., Sinitsky M.Y., Sinitskaya A.V., Markova V.E. Endothelial Dysfunction in the Context of Blood-Brain Barrier Modeling. J Evol Biochem Physiol. 2022;58(3):781-806. doi: 10.1134/S0022093022030139.

3. Gimbrone M.A.Jr., García-Cardeña G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circ Res. 2016;118(4):620-36. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.306301.

4. Ungvari Z., Tarantini S., Kiss T., Wren J.D., Giles C.B., Griffin C.T., Murfee W.L., Pacher P., Csiszar A. Endothelial dysfunction and angiogenesis impairment in the ageing vasculature. Nat Rev Cardiol. 2018;15(9):555-565. doi: 10.1038/s41569-018-0030-z.

5. Bonaventura A., Vecchié A., Dagna L., Martinod K., Dixon D.L., Van Tassell B.W., Dentali F., Montecucco F., Massberg S., Levi M., Abbate A. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19. Nat Rev Immunol. 2021;21(5):319-329. doi: 10.1038/s41577-021-00536-9.

6. Baaten C.C.F.M.J., Vondenhoff S., Noels H. Endothelial Cell Dysfunction and Increased Cardiovascular Risk in Patients With Chronic Kidney Disease. Circ Res. 2023;132(8):970-992. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.321752.

7. Segers V.F.M., Bringmans T., De Keulenaer G.W. Endothelial dysfunction at the cellular level in three dimensions: severity, acuteness, and distribution. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2023;325(2):H398-H413. doi: 10.1152/ajpheart.00256.2023.

8. Kozlov S., Okhota S., Avtaeva Y., Melnikov I., Matroze E., Gabbasov Z. Von Willebrand factor in diagnostics and treatment of cardiovascular disease: Recent advances and prospects. Front Cardiovasc Med. 2022;9:1038030. doi: 10.3389/fcvm.2022.1038030.

9. Goncharov N.V., Popova P.I., Kudryavtsev I.V., Golovkin A.S., Savitskaya I.V., Avdonin P.P., Korf E.A., Voitenko N.G., Belinskaia D.A., Serebryakova M.K., Matveeva N.V., Gerlakh N.O., Anikievich N.E., Gubatenko M.A., Dobrylko I.A., Trulioff A.S., Aquino A.D., Jenkins R.O., Avdonin P.V. Immunological Profile and Markers of Endothelial Dysfunction in Elderly Patients with Cognitive Impairments. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1888. doi: 10.3390/ijms25031888.

10. Alexander Y., Osto E., Schmidt-Trucksäss A., Shechter M., Trifunovic D., Duncker D.J., Aboyans V., Bäck M., Badimon L., Cosentino F., De Carlo M., Dorobantu M., Harrison D.G., Guzik T.J., Hoefer I., Morris P.D., Norata G.D., Suades R., Taddei S., Vilahur G., Waltenberger J., Weber C., Wilkinson F., Bochaton-Piallat M.L., Evans P.C. Endothelial function in cardiovascular medicine: a consensus paper of the European Society of Cardiology Working Groups on Atherosclerosis and Vascular Biology, Aorta and Peripheral Vascular Diseases, Coronary Pathophysiology and Microcirculation, and Thrombosis. Cardiovasc Res. 2021;117(1):29-42. doi: 10.1093/cvr/cvaa085.

11. Janaszak-Jasiecka A., Siekierzycka A., Płoska A., Dobrucki I.T., Kalinowski L. Endothelial Dysfunction Driven by Hypoxia-The Influence of Oxygen Deficiency on NO Bioavailability. Biomolecules. 2021;11(7):982. doi: 10.3390/biom11070982.

12. Dowsett L., Higgins E., Alanazi S., Alshuwayer N.A., Leiper F.C., Leiper J. ADMA: A Key Player in the Relationship between Vascular Dysfunction and Inflammation in Atherosclerosis. J Clin Med. 2020;9(9):3026. doi: 10.3390/jcm9093026.

13. Evans P.C., Rainger G.E., Mason J.C., Guzik T.J., Osto E., Stamataki Z., Neil D., Hoefer I.E., Fragiadaki M., Waltenberger J., Weber C., Bochaton-Piallat M.L., Bäck M. Endothelial dysfunction in COVID-19: a position paper of the ESC Working Group for Atherosclerosis and Vascular Biology, and the ESC Council of Basic Cardiovascular Science. Cardiovasc Res. 2020;116(14):2177-2184. doi: 10.1093/cvr/cvaa230.

14. Feenstra L., Kutikhin A.G., Shishkova D.K., Buikema H., Zeper L.W., Bourgonje A.R., Krenning G., Hillebrands J.L. Calciprotein Particles Induce Endothelial Dysfunction by Impairing Endothelial Nitric Oxide Metabolism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023;43(3):443-455. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318420.

15. Kostyunin A., Glushkova T., Velikanova E., Mukhamadiyarov R., Bogdanov L., Akentyeva T., Ovcharenko E., Evtushenko A., Shishkova D., Markova Y., Kutikhin A. Embedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy (EM-BSEM) Is Preferential over Immunophenotyping in Relation to Bioprosthetic Heart Valves. Int J Mol Sci. 2023;24(17):13602. doi: 10.3390/ijms241713602.

16. Bogdanov L., Shishkova D., Mukhamadiyarov R., Velikanova E., Tsepokina A., Terekhov A., Koshelev V., Kanonykina A., Shabaev A., Frolov A., Zagorodnikov N., Kutikhin A. Excessive Adventitial and Perivascular Vascularisation Correlates with Vascular Inflammation and Intimal Hyperplasia. Int J Mol Sci. 2022;23(20):12156. doi: 10.3390/ijms232012156.

17. Mukhamadiyarov R.A., Bogdanov L.A., Glushkova T.V., Shishkova D.K., Kostyunin A.E., Koshelev V.A., Shabaev A.R., Frolov A.V., Stasev A.N., Lyapin A.A., Kutikhin A.G. EMbedding and Backscattered Scanning Electron Microscopy: A Detailed Protocol for the Whole-Specimen, High-Resolution Analysis of Cardiovascular Tissues. Front Cardiovasc Med. 2021;8:739549. doi: 10.3389/fcvm.2021.739549.

18. Trimm E., Red-Horse K. Vascular endothelial cell development and diversity. Nat Rev Cardiol. 2023;20(3):197-210. doi: 10.1038/s41569-022-00770-1.

19. Ricard N., Bailly S., Guignabert C., Simons M. The quiescent endothelium: signalling pathways regulating organ-specific endothelial normalcy. Nat Rev Cardiol. 2021;18(8):565-580. doi: 10.1038/s41569-021-00517-4.

20. Gao Y., Galis Z.S. Exploring the Role of Endothelial Cell Resilience in Cardiovascular Health and Disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(1):179-185. doi: 10.1161/ATVBAHA.120.314346.

21. Tombor L.S., Dimmeler S. Why is endothelial resilience key to maintain cardiac health? Basic Res Cardiol. 2022;117(1):35. doi: 10.1007/s00395-022-00941-8.

22. McQueen A., Warboys C.M. Mechanosignalling pathways that regulate endothelial barrier function. Curr Opin Cell Biol. 2023;84:102213. doi: 10.1016/j.ceb.2023.102213.

23. Hamrangsekachaee M., Wen K., Bencherif S.A., Ebong E.E. Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research. Am J Physiol Cell Physiol. 2023;324(2):C488-C504. doi: 10.1152/ajpcell.00449.2022.

24. Wang X., Shen Y., Shang M., Liu X., Munn L.L. Endothelial mechanobiology in atherosclerosis. Cardiovasc Res. 2023;119(8):1656-1675. doi: 10.1093/cvr/cvad076.

25. Bloom S.I., Islam M.T., Lesniewski L.A., Donato A.J. Mechanisms and consequences of endothelial cell senescence. Nat Rev Cardiol. 2023;20(1):38-51. doi: 10.1038/s41569-022-00739-0.