СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ОКРАШИВАНИЯ КОНСТИТУТИВНЫХ БЕЛКОВ И ОБЩЕГО БЕЛКА КАК ДВУХ ПОДХОДОВ К НОРМАЛИЗАЦИИ СИГНАЛА ПРИ ИММУНОБЛОТТИНГЕ БЕЛКОВ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК И КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ

Основные положения

• Наиболее высокой чувствительностью при окрашивании общего белка в лизате культур эндотелиальных клеток и гомогенате кровеносных сосудов имеют красители Acid Black 1 и Fast Green FCF, позволяющие детектировать ≥ 1 мкг белка).
• При оценке содержания конститутивных белков в лизатах культур эндотелиальных клеток наиболее высокой чувствительностью обладает окрашивание антителами к β-актину (детектирующее ≥ 1–2 мкг белка), TBP (≥ 2–4 мкг белка) и PCNA (≥ 4 мкг белка).
• При нормализации специфичного сигнала от антител целесообразно применять окрашивание на общий белок при коэффициенте вариации ≤ 20% (для лизата культур эндотелиальных клеток) или ≤ 25% (для гомогената кровеносных сосудов).

Цель. Провести сравнение объективности окрашивания конститутивных белков и общего белка как двух методик для нормализации сигнала при иммуноблоттинге белков эндотелиальных клеток (ЭК) и кровеносных сосудов.

Материал и методы. В бис-трис-гель для электрофореза вносили серийные разведения лизата культур ЭК или гомогената кровеносных сосудов (1, 2, 4, 8, 16 и 32 мкг белка). Окрашивание конститутивных белков ЭК (CD31/PECAM1, β-актина, β-тубулина, GAPDH, TBP, PCNA, гистона H3 и COX4) детектировали с использованием вторичных антител, конъюгированных с флюорофорами 680RD и 800CW (флюоресцентная детекция) либо с пероксидазой хрена (хемилюминесцентная детекция). Визуализацию общего белка проводили при помощи красителей Acid Black 1, Fast Green FCF, Понсо S, Конго красного, нигрозина, красителя Revert 700 и 2,2,2-трихлорэтанола.

Результаты. При окрашивании общего белка из лизата культур ЭК или гомогената кровеносных сосудов на мембранах из поливинилиденфторида и нитроцеллюлозы наиболее высокую чувствительность продемонстрировали краситель Acid Black 1 и Fast Green FCF (позволявшие детектировать ≥ 1 мкг белка), которые были выбраны для последующего сравнения. При анализе экспрессии конститутивных белков ЭК и кровеносных сосудов наиболее высокая чувствительность была выявлена при окрашивании антителами к β-актину (≥ 1–2 мкг белка), TBP (≥ 2–4 мкг белка) и PCNA (≥ 4 мкг белка). Чувствительность окрашивания общего белка превысила чувствительность окрашивания антителами к β-актину и TBP (за счет более высокой интенсивности полос). Сплошной анализ результатов окрашивания общего белка выявил максимальный и медианный коэффициент вариации при анализе лизата культур ЭК в ≈ 20% и ≈ 12% соответственно, при анализе гомогената кровеносных сосудов – в ≈ 40% и ≈ 17%.

Заключение. Наиболее чувствительным красителем для окрашивания общего белка в лизате культур ЭК и гомогенате кровеносных сосудов является Acid Black 1, цитоплазматическим конститутивным белком – β-актин, ядерным конститутивным белком – TBP. При нормализации специфичного сигнала от антител целесообразно применять окрашивание на общий белок при коэффициенте вариации ≤ 20% (для лизата культур ЭК) или ≤ 25% (для гомогената кровеносных сосудов).

1. Wang Q, Han W, Ma C, Wang T, Zhong J. Western blot normalization: Time to choose a proper loading control seriously. Electrophoresis. 2023;44(9–10):854–863; doi: 10.1002/elps.202200222.

2. Rajalekshmi R, Rai V, Agrawal DK. 14-3-3ζ: an optimal housekeeping protein for western blot analysis in swine rotator cuff tendon studies. Mol Cell Biochem. 2025;480(7):4355–4363; doi: 10.1007/s11010-025-05255-6.

3. Hu X, Du S, Yu J, Yang X, Yang C, Zhou D, Wang Q, Qin S, Yan X, He L, Han D, Wan C. Common housekeeping proteins are upregulated in colorectal adenocarcinoma and hepatocellular carcinoma, making the total protein a better 'housekeeper'. Oncotarget. 2016;7(41):66679–66688; doi: 10.18632/oncotarget.11439.

4. Maloy A, Alexander S, Andreas A, Nyunoya T, Chandra D. Stain-Free total-protein normalization enhances the reproducibility of Western blot data. Anal Biochem. 2022;654:114840; doi: 10.1016/j.ab.2022.114840.

5. Westerberg LJ, Dedic B, Näslund E, Thorell A, Spalding KL. Superior normalization using total protein for western blot analysis of human adipocytes. PLoS One. 2025;20(7):e0328136; https://doi: 10.1371/journal.pone.0328136.

6. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting. Methods. 2006;38(4):283–293; doi: 10.1016/j.ymeth.2005.11.007.

7. Xiang Y, Zheng Y, Liu S, Liu G, Li Z, Dong W. Comparison of the sensitivity of Western blotting between PVDF and NC membranes. Sci Rep. 2021;11(1):12022; doi: 10.1038/s41598-021-91521-8.

8. Шишкова Д.К., Синицкая А.В., Синицкий М.Ю., Матвеева В.Г., Великанова Е.А., Маркова В.Е., Кутихин А.Г. Случай спонтанного эндотелиально-мезенхимального перехода в культуре первичных ЭК пупочной вены человека. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2022;11(3):97-114. doi: 10.17802/2306-1278-2022-11-3-97-114.

9. Маркова В.Е., Шишкова Д.К., Кутихин А.Г. Анализ внутреннего пути апоптоза в эндотелиальных клетках под воздействием кальций-фосфатных бионов. Фундаментальная и клиническая медицина. 2020. Т. 5. № 3. С. 50–58; doi: 10.23946/2500-0764-2020-5-3-50-58.

10. Kostina D, Lobov A, Klausen P, Karelkin V, Tikhilov R, Bozhkova S, Sereda A, Ryumina N, Enukashvily N, Malashicheva A. Isolation of human osteoblast cells capable for mineralization and synthesizing bone-related proteins in vitro from adult bone. Cells. 2022;11:3356; doi: 10.3390/cells11213356.

11. Antonova LV, Sevostianova VV, Silnikov VN, Krivkina EO, Velikanova EA, Mironov AV, Shabaev AR, Senokosova EA, Khanova MY, Glushkova TV, Akentieva TN, Sinitskaya AV, Markova VE, Shishkova DK, Lobov AA, Repkin EA, Stepanov AD, Kutikhin AG, Barbarash LS. Comparison of the patency and regenerative potential of biodegradable vascular prostheses of different polymer compositions in an ovine model. Int J Mol Sci. 2023;24:8540; doi: 10.3390/ijms24108540.

12. Kanonykina A, Velikanova E, Markova V, Bogdanov L, Shishkova D, Shabaev A, Sinitsky M, Sinitskaya A, Poddubnyak A, Lazebnaya A, Stepanov A, Tyurina A, Lobov A, Zainullina B, Yuzhalin A, Kutikhin A. Citrullination accompanies the development of carotid atherosclerotic plaques. Curr Med Chem. 2024; doi: 10.2174/0109298673327175240929222308.

13. Parkin GM, Udawela M, Gibbons A, Dean B. Beta-actin does not show the characteristics of a reference protein in human cortex. Electrophoresis. 2019;40(2):247–253. doi: 10.1002/elps.201800328.

14. Vigelsø A, Dybboe R, Hansen CN, Dela F, Helge JW, Guadalupe Grau A. GAPDH and beta-actin protein decreases with aging, making Stain-Free technology a superior loading control in Western blotting of human skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 2015;118(3):386–394. doi: 10.1152/japplphysiol.00840.2014.

15. Yang M, Yan J, Wu A, Zhao W, Qin J, Pogwizd SM, Wu X, Yuan S, Ai X. Alterations of housekeeping proteins in human aged and diseased hearts. Pflugers Arch. 2021;473(3):351–362. doi: 10.1007/s00424-021-02538-x.

16. Wu Y, Wu M, He G, Zhang X, Li W, Gao Y, Li Z, Wang Z, Zhang C. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: a universal internal control for Western blots in prokaryotic and eukaryotic cells. Anal Biochem. 2012;423(1):15–22. doi: 10.1016/j.ab.2012.01.012.

17. Li R, Shen Y. An old method facing a new challenge: re-visiting housekeeping proteins as internal reference control for neuroscience research. Life Sci. 2013;92(13): 747751. doi: 10.1016/j.lfs.2013.02.014.

18. Bass JJ, Wilkinson DJ, Rankin D, Phillips BE, Szewczyk NJ, Smith K, Atherton PJ. An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research. Scand J Med Sci Sports. 2017;27(1):4–25. doi: 10.1111/sms.12702.

19. Moritz CP. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 2017;17(20). doi: 10.1002/pmic.201600189.

20. Pillai-Kastoori L, Schutz-Geschwender AR, Harford JA. A systematic approach to quantitative Western blot analysis. Anal Biochem. 2020;593:113608. doi: 10.1016/j.ab.2020.113608.

21. Butler TAJ, Paul JW, Chan EC, Smith R, Tolosa JM. Misleading Westerns: Common Quantification Mistakes in Western Blot Densitometry and Proposed Corrective Measures. Biomed Res Int. 2019;2019:5214821. doi: 10.1155/2019/5214821.

22. Fosang AJ, Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. 2015;290(50):29692–29694. doi: 10.1074/jbc.E115.000002.

23. Faden F, Eschen-Lippold L, Dissmeyer N. Normalized Quantitative Western Blotting Based on Standardized Fluorescent Labeling. Methods Mol Biol. 2016;1450:247–258. doi: 10.1007/978-1-4939-3759-2_20.

24. Kshirsagar S, Islam MA, Reddy AP, Reddy PH. Resolving the current controversy of use and reuse of housekeeping proteins in ageing research: Focus on saving people's tax dollars. Ageing Res Rev. 2024;100:102437. doi: 10.1016/j.arr.2024.102437.

25. Eaton SL, Hurtado ML, Oldknow KJ, Graham LC, Marchant TW, Gillingwater TH, Farquharson C, Wishart TM. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. 2014;93:e52099. doi: 10.3791/52099.

26. Janes KA. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 2015;8(371):rs2. doi: 10.1126/scisignal.2005966.

27. Barkovits K, Pfeiffer K, Eggers B, Marcus K. Protein Quantification Using the "Rapid Western Blot" Approach. Methods Mol Biol. 2021;2228:29–39. doi: 10.1007/978-1-0716-1024-4_3.

28. Cui Y. Optimization of blocking conditions for fluorescent Western blot. Analytical Biochemistry. 2020;593:113598. doi: 10.1016/j.ab.2020.113598.

29. Park J, Mabuchi M, Sharma A. Multiplexed Fluorescent Immunodetection Using Low Autofluorescence Immobilon®-FL Membrane. Methods Mol Biol. 2015;1314:195–205. doi: 10.1007/978-1-4939-2718-0_22.

30. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of Proteins on Blot Membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1–10.8.11. doi: 10.1002/cpps.15.

31. Thacker JS, Yeung DH, Staines WR, Mielke JG. Total protein or high-abundance protein: Which offers the best loading control for Western blotting? Anal Biochem. 2016;496:76–78. doi: 10.1016/j.ab.2015.11.022.

32. Wang Q, Han W, Ma C, Wang T, Zhong J. Western blot normalization: Time to choose a proper loading control seriously. Electrophoresis. 2023;44(9-10):854–863. doi: 10.1002/elps.202200222.

33. Lallier SW, Hill CL, Nichols DP, Reynolds SD. Protein Abundance Determination: An Optimized Western Blot Workflow. Ann Clin Lab Sci. 2019;49(4):507–512.

34. Sander H, Wallace S, Plouse R, Tiwari S, Gomes AV. Ponceau S waste: Ponceau S staining for total protein normalization. Anal Biochem. 2019;575:44–53. doi: 10.1016/j.ab.2019.03.010.

35. Wang JL, Zhao L, Li MQ, Chen WG, Xu CJ. A sensitive and reversible staining of proteins on blot membranes. Anal Biochem. 2020;592:113579. doi: 10.1016/j.ab.2020.113579.

36. Wang JL, Li MQ, Zhang JJ, Xu CJ. Total protein staining with Congo red as an alternative loading control for western blot analysis. Biotech Histochem. 2022;97(6):404–414. doi: 10.1080/10520295.2021.2008008.

37. Aldridge GM, Podrebarac DM, Greenough WT, Weiler IJ. The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting. J Neurosci Methods. 2008;172(2):250–254. doi: 10.1016/j.jneumeth.2008.05.003.

38. Zeng L, Guo J, Xu HB, Huang R, Shao W, Yang L, Wang M, Chen J, Xie P. Direct Blue 71 staining as a destaining-free alternative loading control method for Western blotting. Electrophoresis. 2013;34(15):2234–2239. doi: 10.1002/elps.201300140.

39. Moritz CP, Marz SX, Reiss R, Schulenborg T, Friauf E. Epicocconone staining: a powerful loading control for Western blots. Proteomics. 2014;14(2-3):162–168. doi: 10.1002/pmic.201300089.

40. Kirshner ZZ, Gibbs RB. Use of the REVERT() total protein stain as a loading control demonstrates significant benefits over the use of housekeeping proteins when analyzing brain homogenates by Western blot: An analysis of samples representing different gonadal hormone states. Mol Cell Endocrinol. 2018;473:156–165. doi: 10.1016/j.mce.2018.01.015.

41. Gilda JE, Gomes AV. Stain-Free total protein staining is a superior loading control to beta-actin for Western blots. Anal Biochem. 2013;440(2):186–188. doi: 10.1016/j.ab.2013.05.027.

42. Colella AD, Chegenii N, Tea MN, Gibbins IL, Williams KA, Chataway TK. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 2012;430(2):108–110. doi: 10.1016/j.ab.2012.08.015.

43. Neris RLS, Dobles AMC, Gomes AV. Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Advantages of Stain-Free Technology. Methods Mol Biol. 2021;2261:443–456. doi: 10.1007/978-1-0716-1186-9_28.

44. Gürtler A, Kunz N, Gomolka M, Hornhardt S, Friedl AA, McDonald K, Kohn JE, Posch A. Stain-Free technology as a normalization tool in Western blot analysis. Anal Biochem. 2013;433(2):105–111. doi: 10.1016/j.ab.2012.10.010.

45. Nie X, Li C, Hu S, Xue F, Kang YJ, Zhang W. An appropriate loading control for western blot analysis in animal models of myocardial ischemic infarction. Biochem Biophys Rep. 2017;12:108–113. doi: 10.1016/j.bbrep.2017.09.001.

46. Bettencourt JW, McLaury AR, Limberg AK, Vargas-Hernandez JS, Bayram B, Owen AR, Berry DJ, Sanchez-Sotelo J, Morrey ME, van Wijnen AJ, Abdel MP. Total Protein Staining is Superior to Classical or Tissue-Specific Protein Staining for Standardization of Protein Biomarkers in Heterogeneous Tissue Samples. Gene Rep. 2020;19:100641. doi: 10.1016/j.genrep.2020.100641.

47. Huang YT, van der Hoorn D, Ledahawsky LM, Motyl AAL, Jordan CY, Gillingwater TH, Groen EJN. Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting. J Vis Exp. 2019;(146). doi: 10.3791/59438

48. Eaton SL, Roche SL, Llavero Hurtado M, Oldknow KJ, Farquharson C, Gillingwater TH, Wishart TM. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 2013;8(8):e72457. doi: 10.1371/journal.pone.0072457.

49. Diller T, Thompson J, Steer B. Biological validation of a novel process and product for quantitating western blots. J Biotechnol. 2021;326:52–60. doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.12.012.

50. Wiśniewski JR, Mann MJ. A Proteomics Approach to the Protein Normalization Problem: Selection of Unvarying Proteins for MS-Based Proteomics and Western Blotting. J Proteome Res. 2016;15(7):2321–2326. doi: 10.1021/acs.jproteome.6b00403.

51. Lee HG, Jo J, Hong HH, Kim KK, Park JK, Cho SJ, Park C. State-of-the-art housekeeping proteins for quantitative western blotting: Revisiting the first draft of the human proteome. Proteomics. 2016;16(13):1863–1867. doi: 10.1002/pmic.201500344.

52. Maestri A, Ehrenborg E, Werngren O, Olin M, Hagberg CE, Pedrelli M, Parini P. Titration-WB: A methodology for accurate quantitative protein determination overcoming reproducibility errors. PLoS One. 2025;20(6):e0325052. doi: 10.1371/journal.pone.0325052.

53. Taylor SC, Posch A. The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Res Int 2014;2014:361590; doi: 10.1155/2014/361590.

54. Taylor SC, Rosselli-Murai LK, Crobeddu B, Plante I. A critical path to producing high quality, reproducible data from quantitative western blot experiments. Sci Rep. 2022;12(1):17599. doi: 10.1038/s41598-022-22294-x.

55. Begum H, Murugesan P, Tangutur AD. Western blotting: a powerful staple in scientific and biomedical research. Biotechniques. 2022;73(1):58–69. doi: 10.2144/btn-2022-0003.