Preview

Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний

Расширенный поиск

Параметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакции

https://doi.org/10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20

Полный текст:

Аннотация

Проведен корреляционный анализ параметров праймеров и эффективности и коэффициента детерминации кПЦР на двух независимых массивах экспериментальных данных.

При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Цель. Выявить, существует ли корреляция между параметрами праймеров, эффективностью и коэффициентом детерминации количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).

Материалы и методы. Выделение РНК производили из первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии с последующим синтезом одноцепочечной комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции. Методом кПЦР с детекцией результата в режиме реального времени (флуоресцентный краситель SYBR Green I) определяли экспрессию следующих генов: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Праймеры разработаны в программе Primer-BLAST. Корреляционный анализ по Спирмену выполнен в программе GraphPad Prism.

Результаты. Коэффициент детерминации коррелировал с количественной оценкой качества праймеров, разработанных в программе Beacon Designer, температурой плавления ампликона и содержанием гуанина – цитозина в обратном праймере. Эффективность кПЦР, напротив, не коррелировала с количественной оценкой качества созданных в Beacon Designer праймеров, но коррелировала с длиной, а также процентным содержанием GC в обратных праймерах. Все указанные коэффициенты корреляции находились в диапазоне от 0,4 до 0,5 либо от -0,4 до -0,5, отражая корреляционную связь средней силы. В то же время остальные параметры (как для пар, так и отдельно прямого и обратного праймеров) не влияли на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.

Заключение При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР. 

Об авторах

Л. А. Богданов
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»
Россия

младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002



Д. К. Шишкова
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»
Россия

младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002



М. Ю. Синицкий
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»
Россия

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002



А. Г. Кутихин
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»
Россия

кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,

Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002



Список литературы

1. Chuang, L.-Y., Cheng, Y.-H., Yang, C.-H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 2013;35(10): 1541–1549. doi:10.1007/s10529-013-1249-8

2. SantaLucia J. Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design. Methods Mol Biol. 2007; 402:3-34. doi: 10.1007/978-1-59745-528-2_1

3. Valones M.A., Guimarães R.L., Brandão L.A., de Souza P.R., de Albuquerque Tavares Carvalho A., Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: A review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1–11.

4. Ando W., Kikuchi K., Uematsu T., Yokomori H., Takaki T., Sogabe M., Kohgo Y., Otori K., Ishikawa S., Okazaki I. Novel breast cancer screening: combined expression of miR-21 and MMP-1 in urinary exosomes detects 95% of breast cancer without metastasis. Sci Rep. 2019; 9(1):13595. doi: 10.1038/s41598-019-50084-5

5. Fretzayas A., Moustaki M., Liapi O., Karpathios T. Gilbert syndrome. Eur J Pediatr. 2012; 171(1):11-5. doi: 10.1007/s00431-011-1641-0

6. Liu Y., Guo Y., Jin X., Mei S., Xie T., Lan Q., Fang Y., Zhu B. Developmental validation study of a 24-plex Y-STR direct amplification system for forensic application. Int J Legal Med. 2019. doi: 10.1007/s00414-019-02220-z

7. Meienberg J., Bruggmann R., Oexle K., Matyas G. Clinical sequencing: is WGS the better WES? Hum Genet. 2016;135(3):359- 62. doi: 10.1007/s00439-015-1631-9.

8. Cankar K., Stebih D., Dreo T., Zel J., Gruden K. Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol. 2006; 6:37. doi: 10.1186/1472-6750-6-37.

9. Bustin S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19–28. doi:10.1016/j.bdq.2017.11.001

10. Li K., Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010; 630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18

11. Robertson J.M., Walsh-Weller J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions. Methods Mol. Biol. 1998; 98:121–154. doi: 10,1385/0-89603-443-7:121

12. Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017; 6 (1): 92-101.

13. Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J.J., Andrade M.J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275:31-56. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3

14. Thornton B., Basu C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 2011;39(2):145-54. doi: 10.1002/bmb.20461

15. Picard-Meyer E., de Garam C., Peytavin, Schereffer J.L., Marchal C., Robardet E., Cliquet F. Cross-platform evaluation of commercial real-time SYBR green RT-PCR kits for sensitive and rapid detection of European bat Lyssavirus type 1. BioMed Res. Int. 2015; 2015:839518. doi: 10.1155/2015/839518

16. Alemayehu S., Feghali K.C., Cowden J., Komisar J., Ockenhouse C.F., Kamau E. Comparative evaluation of published real-time PCR assays for the detection of malaria following MIQE guidelines. Malar. J. 2013; 12:277. doi: 10.1186/1475-2875-12-277

17. Buzard G.S., Baker D., Wolcott M.J., Norwood D.A., Dauphin L.A. Multi-platform comparison of ten commercial master mixes for probe-based real-time polymerase chain reaction detection of bioterrorism threat agents for surge preparedness. Forensic Sci. Int. 2012; 223:292–297. doi: 10.1016/j.forsciint.2012.10.003

18. D’haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18–24.


Для цитирования:


Богданов Л.А., Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Кутихин А.Г. Параметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакции. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020;9(3):13-20. https://doi.org/10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20

For citation:


Bogdanov L.A., Shishkova D.K., Sinitsky M.Yu., Kutikhin A.G. Primer parameters defining efficiency and coefficient of determination in quantitative polymerase chain reaction. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2020;9(3):13-20. (In Russ.) https://doi.org/10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20

Просмотров: 51


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2306-1278 (Print)
ISSN 2587-9537 (Online)