Параметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакции
https://doi.org/10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20
Аннотация
Проведен корреляционный анализ параметров праймеров и эффективности и коэффициента детерминации кПЦР на двух независимых массивах экспериментальных данных.
При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.
Цель. Выявить, существует ли корреляция между параметрами праймеров, эффективностью и коэффициентом детерминации количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).
Материалы и методы. Выделение РНК производили из первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии с последующим синтезом одноцепочечной комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции. Методом кПЦР с детекцией результата в режиме реального времени (флуоресцентный краситель SYBR Green I) определяли экспрессию следующих генов: IL1B, IL6, CXCL8, IL12A, IL23A, PECAM1, VWF, KDR, FAPA, ACTA2, SMTN, VIM, COL4A1, MMP2, SNAI2, TWIST1, ZEB1, SCARF1, CD36, LDLR, VLDLR, VCAM1, ICAM1, SELE, SELP, CDH5, IL1R1, IL1R2, TNFRSF1A, TNFRSF1B, NOS3, PXDN. Праймеры разработаны в программе Primer-BLAST. Корреляционный анализ по Спирмену выполнен в программе GraphPad Prism.
Результаты. Коэффициент детерминации коррелировал с количественной оценкой качества праймеров, разработанных в программе Beacon Designer, температурой плавления ампликона и содержанием гуанина – цитозина в обратном праймере. Эффективность кПЦР, напротив, не коррелировала с количественной оценкой качества созданных в Beacon Designer праймеров, но коррелировала с длиной, а также процентным содержанием GC в обратных праймерах. Все указанные коэффициенты корреляции находились в диапазоне от 0,4 до 0,5 либо от -0,4 до -0,5, отражая корреляционную связь средней силы. В то же время остальные параметры (как для пар, так и отдельно прямого и обратного праймеров) не влияли на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.
Заключение При соблюдении основных правил разработки праймеров их параметры не влияют на эффективность и коэффициент детерминации кПЦР.
Об авторах
Л. А. БогдановРоссия
младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,
Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002
Д. К. Шишкова
Россия
младший научный сотрудник лаборатории фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,
Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002
М. Ю. Синицкий
Россия
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномной медицины отдела экспериментальной медицины,
Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002
А. Г. Кутихин
Россия
кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией фундаментальных аспектов атеросклероза отдела экспериментальной медицины,
Сосновый бульвар, 6, Кемерово, 650002
Список литературы
1. Chuang, L.-Y., Cheng, Y.-H., Yang, C.-H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnology Letters. 2013;35(10): 1541–1549. doi:10.1007/s10529-013-1249-8
2. SantaLucia J. Jr. Physical principles and visual-OMP software for optimal PCR design. Methods Mol Biol. 2007; 402:3-34. doi: 10.1007/978-1-59745-528-2_1
3. Valones M.A., Guimarães R.L., Brandão L.A., de Souza P.R., de Albuquerque Tavares Carvalho A., Crovela S. Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: A review. Braz J Microbiol. 2009; 40:1–11.
4. Ando W., Kikuchi K., Uematsu T., Yokomori H., Takaki T., Sogabe M., Kohgo Y., Otori K., Ishikawa S., Okazaki I. Novel breast cancer screening: combined expression of miR-21 and MMP-1 in urinary exosomes detects 95% of breast cancer without metastasis. Sci Rep. 2019; 9(1):13595. doi: 10.1038/s41598-019-50084-5
5. Fretzayas A., Moustaki M., Liapi O., Karpathios T. Gilbert syndrome. Eur J Pediatr. 2012; 171(1):11-5. doi: 10.1007/s00431-011-1641-0
6. Liu Y., Guo Y., Jin X., Mei S., Xie T., Lan Q., Fang Y., Zhu B. Developmental validation study of a 24-plex Y-STR direct amplification system for forensic application. Int J Legal Med. 2019. doi: 10.1007/s00414-019-02220-z
7. Meienberg J., Bruggmann R., Oexle K., Matyas G. Clinical sequencing: is WGS the better WES? Hum Genet. 2016;135(3):359- 62. doi: 10.1007/s00439-015-1631-9.
8. Cankar K., Stebih D., Dreo T., Zel J., Gruden K. Critical points of DNA quantification by real-time PCR-effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnol. 2006; 6:37. doi: 10.1186/1472-6750-6-37.
9. Bustin S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification, Biomol Detect Quantif. 2017; 14: 19–28. doi:10.1016/j.bdq.2017.11.001
10. Li K., Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010; 630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18
11. Robertson J.M., Walsh-Weller J. An introduction to PCR primer design and optimization of amplification reactions. Methods Mol. Biol. 1998; 98:121–154. doi: 10,1385/0-89603-443-7:121
12. Кутихин А.Г., Синицкий М.Ю., Понасенко А.В. Роль мутагенеза в развитии атеросклероза. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2017; 6 (1): 92-101.
13. Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J.J., Andrade M.J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 2015; 1275:31-56. doi: 10.1007/978-1-4939-2365-6_3
14. Thornton B., Basu C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 2011;39(2):145-54. doi: 10.1002/bmb.20461
15. Picard-Meyer E., de Garam C., Peytavin, Schereffer J.L., Marchal C., Robardet E., Cliquet F. Cross-platform evaluation of commercial real-time SYBR green RT-PCR kits for sensitive and rapid detection of European bat Lyssavirus type 1. BioMed Res. Int. 2015; 2015:839518. doi: 10.1155/2015/839518
16. Alemayehu S., Feghali K.C., Cowden J., Komisar J., Ockenhouse C.F., Kamau E. Comparative evaluation of published real-time PCR assays for the detection of malaria following MIQE guidelines. Malar. J. 2013; 12:277. doi: 10.1186/1475-2875-12-277
17. Buzard G.S., Baker D., Wolcott M.J., Norwood D.A., Dauphin L.A. Multi-platform comparison of ten commercial master mixes for probe-based real-time polymerase chain reaction detection of bioterrorism threat agents for surge preparedness. Forensic Sci. Int. 2012; 223:292–297. doi: 10.1016/j.forsciint.2012.10.003
18. D’haene B, Hellemans J. The importance of quality control during qPCR data analysis. Int Drug Disc: 2010; 18–24.
Рецензия
Для цитирования:
Богданов Л.А., Шишкова Д.К., Синицкий М.Ю., Кутихин А.Г. Параметры праймеров, коррелирующие с коэффициентом детерминации и эффективностью количественной полимеразной цепной реакции. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2020;9(3):13-20. https://doi.org/10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20
For citation:
Bogdanov L.A., Shishkova D.K., Sinitsky M.Yu., Kutikhin A.G. Primer parameters defining efficiency and coefficient of determination in quantitative polymerase chain reaction. Complex Issues of Cardiovascular Diseases. 2020;9(3):13-20. (In Russ.) https://doi.org/10.17802/2306-1278-2020-9-3-13-20